【摘要】：目的:從大鼠骨髓中分離出具有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞方法:大鼠全骨髓培養(yǎng),貼壁篩選法純化傳代。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征,流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面抗原表達(dá)。成骨,成脂,成軟骨分化實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞分化功能。結(jié)果:通過貼壁篩選的方法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,至第3代時(shí)貼壁細(xì)胞接近80%-90%融合,鏡下觀察可見細(xì)胞形態(tài)呈比較均一的成纖維狀,連續(xù)傳代,細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。流式結(jié)果顯示:超過90%大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞性表達(dá)CD29(細(xì)胞整合素分子)CD90;超過80%大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞性表達(dá)CD44(粘附分子,介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)透明質(zhì)酸和骨橋蛋白的粘附)、CD73。不表達(dá)CD34(祖細(xì)胞表面的分化抗原)CD45和造血祖細(xì)胞表面標(biāo)志CD11b,符合大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特征。成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化結(jié)果顯示:成脂誘導(dǎo)72小時(shí)后,鏡下觀察可見細(xì)胞胞質(zhì)染色加深,約5天后細(xì)胞內(nèi)有小脂滴出現(xiàn),誘導(dǎo)過程脂滴數(shù)量增加并相互融合,細(xì)胞由長梭形變?yōu)閳A形或多邊形。誘導(dǎo)15天后,油紅O染色顯示有大量脂質(zhì)沉淀。成骨誘導(dǎo)約3天細(xì)胞有所增值,細(xì)胞呈多角形;6天,胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒,細(xì)胞呈集落樣聚集,細(xì)胞間可見少量鈣質(zhì)沉積;10天后,細(xì)胞結(jié)節(jié)中心的細(xì)胞逐漸融合失去細(xì)胞結(jié)構(gòu),鈣結(jié)節(jié)形成明顯;16天,細(xì)胞表面出現(xiàn)大量鈣質(zhì)沉積,經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)。成軟骨誘導(dǎo)24小時(shí)后,細(xì)胞成一團(tuán)顆粒狀漂浮在誘導(dǎo)液中,誘導(dǎo)過程細(xì)胞團(tuán)表面逐漸變得光滑,誘導(dǎo)21天后,固定染色表現(xiàn)為軟骨特征。符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化特征。結(jié)論:大鼠全骨髓培養(yǎng),貼壁篩選法純化傳代可成功分離得到大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞。目的:采用改良型Ono術(shù)式建立大鼠腹腔異位心臟移植模型方法:wistar大鼠心臟作為供體,SD大鼠作為受體,采用改良型Ono術(shù)式建立大鼠腹腔異位心臟移植模型。后采用多普勒心臟彩超、HE染色評(píng)估模型建立效果。結(jié)果:心臟移植建模7天、15天后大鼠移植心臟左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVEDs)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室短軸縮短指數(shù)(FS)顯示成功建立大鼠腹腔異位心臟移植模型。移植心臟形大體觀可見:移植7天后移植心臟顏色與剛移植心臟顏色相同為紅色,腹腔內(nèi)可見積液。15天后心臟顏色明顯變得暗淡,周圍腸管腫脹。30天后移植心臟顏色變暗,與周圍腸管發(fā)生粘連。HE染色顯示:移植7天心肌細(xì)胞排列稍紊亂血管周圍可見少量炎癥細(xì)胞浸潤。移植15天后心肌細(xì)胞排列紊亂,血竇內(nèi)可見炎癥細(xì)胞浸潤。30天后心肌心肌細(xì)胞排列非常紊亂,血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤。結(jié)論:采用改良型Ono術(shù)式成功建立大鼠腹腔異位心臟移植模型,并降低死亡率。目的:體外明確大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分泌的Exsome發(fā)揮免疫抑制效果的靶細(xì)胞,體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證體外結(jié)果。明確大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的Exsome在移植心臟存活中的作用。方法:1、體外采用BMSCs分泌的exosome與DC細(xì)胞共培養(yǎng)、BMSCs分泌的exosome與T細(xì)胞共培養(yǎng)、BMSCs分泌的exosome與DC細(xì)胞+ T細(xì)胞共培養(yǎng)。DC細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)、T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)、C細(xì)胞與T細(xì)胞共同培養(yǎng)作為陰性對(duì)照。將BMSCs細(xì)胞分泌的exosome調(diào)整終濃度為800mg/ml,使每組加入濃度—致,DC細(xì)胞、T細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照1:1的比例混合培養(yǎng)48H、72H、96H后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測DC細(xì)胞和T細(xì)胞表面分子表達(dá)量。2、大鼠腹腔異位移植心臟模型建立后經(jīng)尾靜脈注射BMSCs分泌的exosome,給予嗎替麥考喂養(yǎng)作為藥物對(duì)照,不做任何處理組作為陰性對(duì)照,正常未移植組作為陰性對(duì)照,在相同條件下喂養(yǎng)2、4、7天后取其脾臟進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測DC細(xì)胞和T細(xì)胞表面分子表達(dá)量。3、大鼠腹腔異位移植心臟模型建立后經(jīng)尾靜脈注射BMSCs分泌的exosome,給予嗎替麥考喂養(yǎng)作為藥物對(duì)照,不做任何處理組作為陰性對(duì)照,在相同條件下喂養(yǎng)2、4、7天采用多普勒心臟彩超和小動(dòng)物活體成像評(píng)估移植心臟功能。結(jié)果:1、BMSCs分泌的exosome在共培養(yǎng)48H與72H時(shí)對(duì)DC細(xì)胞的作用沒有明顯的規(guī)律,當(dāng)在共培養(yǎng)達(dá)到96H時(shí)對(duì)DC細(xì)胞的作用開始出現(xiàn)規(guī)律性的變化。當(dāng)BMSCs分泌的exosome在與T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),Treg細(xì)胞表達(dá)量在48H、72H時(shí)都為最高,在96H時(shí)有所降低但無顯著性差異。CD3+CD4表達(dá)量在48H、72H時(shí)都為最低,在96H時(shí)有所升高。CD3+CD8表達(dá)量在48H、72H、96H時(shí)都最低。2、BMSCs分泌的exosome對(duì)DC細(xì)胞的作用沒有明顯的規(guī)律,而其Treg細(xì)胞表達(dá)量在喂養(yǎng)2天后表達(dá)量為各組最高、在喂養(yǎng)4天后較嗎替麥考組表達(dá)有所降低,但無顯著性差異,較模型未處理組與正常組上升、在喂養(yǎng)7天后正常組表達(dá)有所降低,但無顯著性差異,較模型未處理組與較嗎替麥考組上升。3、心臟彩超結(jié)果顯示:大鼠移植模型建立后給予BMSCs分泌的exosome處理后2天移植心臟射血分?jǐn)?shù)、環(huán)比收縮較建模未處理組有顯著改善,與嗎替麥考組無顯著性差異,移植模型建立后給予BMSCs分泌的exosome處理后4天移植心臟射血分?jǐn)?shù)、環(huán)比收縮較建模未處理組有顯著改善,較嗎替麥考組心臟功能有所上升,移植模型建立后給予BMSCs分泌的exosome處理后7天移植心臟射血分?jǐn)?shù)、環(huán)比收縮較其他各組均有顯著改善。小動(dòng)物活體成像結(jié)果顯示:大鼠移植模型建立后給予BMSCs分泌的exosome處理后2天、4天、7天移植心臟熒光強(qiáng)度均為各組最強(qiáng)。結(jié)論:大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的exosome發(fā)揮免疫抑制作用的靶細(xì)胞為T細(xì)胞,可促進(jìn)exosome聚集于移植心臟并改善其功能。
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【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R654.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 賀繼剛;王平;李洪榮;;外排體的研究概況[J];醫(yī)學(xué)綜述;2015年18期

2 賀繼剛;沈振亞;滕小梅;丁英龍;楊少雷;陳磊;;采用改良Ono方法作大鼠腹腔異位心臟移植研究[J];浙江臨床醫(yī)學(xué);2013年02期

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本文編號(hào)：2439269