【摘要】：全身麻醉藥在臨床手術(shù)中被廣泛應(yīng)用,在圍術(shù)期顯著影響患者的多種生理功能,尤其是感覺功能。聽覺作為人體感受外界信息的重要方式,在全身麻醉過程中,往往是最后消失,而在麻醉蘇醒中是最先恢復(fù)的,因此聽覺功能在臨床實踐中常常被用作判斷麻醉狀態(tài)的重要指標(biāo)之一。研究麻醉劑對聽覺功能的影響具有重要的臨床意義,也越來越被予以重視。在臨床麻醉中,一些病人出現(xiàn)了聽力損傷,而這種聽力受損有些是有臨床癥狀可以被發(fā)現(xiàn)重視的,而絕大多數(shù)是亞臨床的,只能通過聽力�？茩z查才能被發(fā)現(xiàn),常常被麻醉醫(yī)生忽視。麻醉過程中多種因素可以影響聽覺,如麻醉方式、體外循環(huán)、耳毒性藥物、血流動力學(xué)變化、中耳壓力改變等。目前已經(jīng)有報道,氧化亞氮可引起昕力損害,氯胺酮可引起患者幻聽、耳鳴。全麻藥對聽覺系統(tǒng)的作用可以分別影響聽覺神經(jīng)中樞和聽覺外周的功能。目前大量的動物實驗和臨床研究都集中于中樞水平,關(guān)于全麻藥對聽覺外周系統(tǒng)作用的研究均為間接檢測耳蝸耳聲發(fā)射來推斷對聽覺外周感受器毛細(xì)胞功能的作用,尚無使用分離毛細(xì)胞通過膜片鉗方法研究全麻藥對毛細(xì)胞功能的研究。已有研究通過該方法確定了水楊酸類、氨基糖苷類抗生素、速尿等藥物對外毛細(xì)胞的損害作用,發(fā)現(xiàn)了其耳毒性機(jī)制。故本研究擬采用膜片鉗技術(shù),檢測氯胺酮對外周聽覺感受器中有耳蝸放大器功能的外毛細(xì)胞細(xì)胞水平電生理特性的影響并探討其作用機(jī)制。目的研究氯胺酮對Sprague Dawley(SD)大鼠耳蝸外毛細(xì)胞細(xì)胞水平電生理反應(yīng)特性的影響,探討氯胺酮對外毛細(xì)胞電生理反應(yīng)的作用機(jī)制,結(jié)合既往研究結(jié)果綜合評價氯胺酮對外毛細(xì)胞的影響,從而對了解全身麻醉藥相關(guān)聽覺損傷,為臨床防治圍術(shù)期暫時性或永久性聽覺損傷提供理論依據(jù)和新的思路。方法本研究采用對單個離體外毛細(xì)胞自身前后對照方法,以避免個體差異對實驗結(jié)果的影響。選用21～28天齡健康成年SD大鼠40只,40-70 g,雌雄不拘,迅速斷頭處死,暴露兩側(cè)耳蝸,直視下迅速解剖出雙側(cè)聽泡置于含正常細(xì)胞外液L-15約2 ml的培養(yǎng)皿中,置于解剖顯微鏡低倍鏡下將聽泡表面的結(jié)締組織剝離干凈,分離出雙側(cè)完整的耳蝸,在高倍鏡下采用機(jī)械-酶分離法獲得離體單個外毛細(xì)胞。用細(xì)螺旋鋼針向上挑開頂端蝸殼,逐層剔除蝸殼,繞著蝸軸改用尖端小于1 mm的鑷子小心夾取頂回及中回基底膜,將基底膜置于含L-15的培養(yǎng)皿中,剪碎后加入膠原酶1V消化5 min,加入新鮮L-15終止消化,用200 μL移液器輕輕吹打使細(xì)胞分散,轉(zhuǎn)置于含有約1 ml L-15細(xì)胞外液直徑1cm的凹槽板內(nèi),靜置10 min貼壁后,置于防震臺顯微鏡下觀察,辨認(rèn)變形及死亡的外毛細(xì)胞。選擇活性好的單離外毛細(xì)胞進(jìn)行觀察和實驗。實驗過程中持續(xù)使用蠕動泵,更換凹槽板中的液體,保證凹槽板中的細(xì)胞外液始終符合實驗條件。使用膜片鉗全細(xì)胞記錄模式記錄。實驗包括5個部分：隨機(jī)選取活性較好外毛細(xì)胞進(jìn)行自身配對實驗。(1)觀察給藥方法對外毛細(xì)胞全細(xì)胞電流的影響：在電壓鉗下,給予連續(xù)變化的階躍式脈沖電壓刺激,比較在5個外毛細(xì)胞在L-15細(xì)胞外液中,分別在無給藥(C組)、1 min后給L-15(L組)約15 s后各電壓下全細(xì)胞電流,繪制穩(wěn)態(tài)電流-電壓(Ⅰ-Ⅴ)曲線。(2)繪制藥物濃度曲線,確定氯胺酮實驗濃度：在電壓鉗下,Vh=3 mV記錄5個外毛細(xì)胞分別前后給藥氯胺酮(1μM/L,10μM/L,100 μM/L,1000 M/L,5000μM/L),比較各組氯胺酮敏感性電流幅度,繪制藥物濃度曲線。(3)觀察100 μM/L氯胺酮對外毛細(xì)胞I-V曲線及靜息膜電位的影響：給予連續(xù)變化的階躍式脈沖電壓刺激,比較在L-15細(xì)胞外液中,10個外毛細(xì)胞在無給藥組(N組)15 S、1 min后給藥100 μM/L氯胺酮(K組)15 s、1 min后重復(fù)N組(N,組)15 s后外毛細(xì)胞各電壓下全細(xì)胞電流,繪制三組穩(wěn)態(tài)I-V曲線；觀察現(xiàn)象后,換成電流鉗Ih=0 pA,比較N、K兩組細(xì)胞靜息膜電位。(4)觀察100 gM/L氯胺酮對外毛細(xì)胞上乙酰膽堿電流的影響：給藥100μM/L乙酰膽堿(Acetylcholine, ACh)比較10個外毛細(xì)胞在Vh=3 mV下將細(xì)胞外液L。15灌流為100μM/L氯胺酮前1min (K1組)、灌流后(K2組)及洗脫后1min (K3組)乙酰膽堿電流IACh。(5)觀察用士的寧阻斷乙酰膽堿受體后外毛細(xì)胞氯胺酮敏感性全細(xì)胞電流的變化：給藥100μM/L氯胺酮,比較10個外毛細(xì)胞分別在Vh=3 mV下L-15細(xì)胞外液灌流為0.1μM/L士的寧前1min (S1組)、灌流后(S2組)及洗脫后lmin(S3組)的氯胺酮敏感性電流。實驗中通道電信號經(jīng)膜片鉗放大器后再經(jīng)A/D. D/A轉(zhuǎn)換器輸入計算機(jī),由pCLAMP 10.3軟件程序發(fā)放刺激和采集信號。應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行Student t檢驗分析,以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。使用Origin 8.0軟件繪制圖形。結(jié)果隨機(jī)選取貼壁良好,細(xì)胞膜光滑完整,胞漿呈半透明狀,細(xì)胞核呈圓形位于胞體底部,細(xì)胞器主要分布于表皮板下和核周,細(xì)胞內(nèi)無布朗運(yùn)動性顆粒,細(xì)胞周圍有明顯光暈,或稱之為雙折射現(xiàn)象,纖毛完整無彎折的外毛細(xì)胞進(jìn)行實驗。(1)典型外毛細(xì)胞在L-15中的I-V曲線表現(xiàn)為在細(xì)胞超極化方向(反轉(zhuǎn)電位以左)總電流為內(nèi)向,在細(xì)胞去極化方向(反轉(zhuǎn)電位以右)總電流為外向,內(nèi)向電流的幅度較小,外向電流在刺激電壓去極化至約-50 mV以上時越來越大,并呈明顯的電壓依賴性和外向整流性。對比5個外毛細(xì)胞在C組和L組中的I-V曲線,發(fā)現(xiàn)兩組各刺激電壓下的膜總電流均無統(tǒng)計學(xué)差異,說明給藥方式(藥流擴(kuò)散)不會對后續(xù)實驗的觀察產(chǎn)生干擾。(2)一個典型外毛細(xì)胞對不同濃度氯胺酮的反應(yīng)為,給藥1 μM/L氯胺酮,細(xì)胞總電流幅度變化為0 pA,10μM/L氯胺酮可使總電流幅度下降17 pA,100gM/L氯胺酮可使總電流幅度下降約80 pA；同樣方法觀察濃度1000 μM/L及5000μM/L氯胺酮,分別可使外毛細(xì)胞總電流幅度下降153 pA.184 pA.可發(fā)現(xiàn)隨著氯胺酮濃度增大,外毛細(xì)胞外向總電流下降幅度隨之增大。共記錄5個外毛細(xì)胞,現(xiàn)象一致。取5個外毛細(xì)胞氯胺酮敏感性電流幅度平均值用Hill方程擬合氯胺酮濃度曲線,半數(shù)有效濃度IC50=117.3μM/L,100μM/L氯胺酮處于曲線最大斜率處,1000μM/L及5000 μM/L濃度下細(xì)胞反應(yīng)逐漸移形為平臺期,以5000μM/L氯胺酮的敏感性電流幅度為100%,100 gM/L氯胺酮敏感性電流幅度接近50%,說明在該濃度下細(xì)胞反應(yīng)最為靈敏,故下面實驗取氯胺酮100μM/L濃度為實驗濃度。(3)繪制10個外毛細(xì)胞在N、K、N’三組的I-V曲線,發(fā)現(xiàn)與N組相比,N’組各指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)差異,K組在去極化超過-36 mV的刺激電壓下細(xì)胞總電流幅度均減小,并且呈電壓依賴性,隨著去極化電壓越大,氯胺酮敏感性電流幅度越大。在-36 mV電壓下,K組比N組總電流減少7 pA,在+68 mV膜電壓下,該值增大至328 pA,但各個電壓下電流減小的比例是一定的(15.5%～17.5%)。與N組相比,K組使外毛細(xì)胞反轉(zhuǎn)電位從55.4±3.6 mV去極化至54.9±3.1mV(n=10,t=0.22,P0.05)。繪制氯胺酮敏感性電流平均I-V曲線,發(fā)現(xiàn)其反轉(zhuǎn)電位為-55.2±6.1 mV,與鉀離子平衡電位相近,故推斷氯胺酮影響的為外毛細(xì)胞上的鉀電流。待細(xì)胞恢復(fù)后,觀察這10個外毛細(xì)胞在電流鉗下100 μM/L氯胺酮對細(xì)胞靜息膜電位的影響,發(fā)現(xiàn)10個外毛細(xì)胞平均靜息膜電位從給藥前的-63.5±8.7 mV變化至63.1±9.5 mV,未發(fā)生明顯變化(P0.05),說明100 μM/L氯胺酮不影響外毛細(xì)胞靜息膜電位。(4)Vh=3 mV下,灌流100 gM/L氯胺酮,比較K1、K2、K3三組乙酰膽堿電流,結(jié)果顯示氯胺酮敏感性電流平均幅度為79±7 pA,乙酰膽堿電流平均幅度為76+18 pA,均與前面結(jié)果中一致,說明氯胺酮與乙酰膽堿對外毛細(xì)胞上外向電流的影響相互獨立,氯胺酮對外毛細(xì)胞電流的影響不是通過調(diào)節(jié)乙酰膽堿流而起效的。(5) Vh=3mV下,灌流0.1 μM/L士的寧,比較S1、S2、S3三組氯胺酮敏感性電流,結(jié)果顯示,灌流士的寧對外毛細(xì)胞電流基線無影響,給藥100 gM/L氯胺酮,氯胺酮敏感性電流平均幅度為78±13 pA,與前面結(jié)果中一致,說明用士的寧阻斷α9/α10nAChR對氯胺酮敏感性電流不產(chǎn)生影響,說明氯胺酮不是通過直接影響外毛細(xì)胞上乙酰膽堿受體而起效的。結(jié)論1.氯胺酮可濃度依賴性抑制外毛細(xì)胞外向膜電流。2.100μM/L氯胺酮引起外毛細(xì)胞I-V曲線-36 mV以上膜電流成比例減小,對外毛細(xì)胞反轉(zhuǎn)電位和靜息膜電位均無影響,說明氯胺酮不通過改變膜電位來影響外毛細(xì)胞電致運(yùn)動。3.氯胺酮的作用可能為抑制鉀電流,結(jié)合外毛細(xì)胞上離子通道和電流的激活電位,推測該電流為鈣離子依賴性鉀電流。4.已有研究發(fā)現(xiàn)100 μM/L氯胺酮可以減小外毛細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,結(jié)合本研究,推測氯胺酮可通過減弱外毛細(xì)胞細(xì)胞骨架上的鈣離子依賴性蛋白磷酸化,增強(qiáng)細(xì)胞骨架整體軸向勁度,引起胞體伸縮運(yùn)動阻尼增大而減弱外毛細(xì)胞電致運(yùn)動幅度。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R614

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