【摘要】：目的亞臨床甲狀腺功能減退癥(subclinicalhypothyroidism,SCH),簡稱亞甲減,是臨床上常見的內(nèi)分泌代謝性疾病。亞甲減患者雖然甲狀腺激素水平在正常范圍內(nèi),但是血清中促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)水平升高,偏離正常參考范圍。已有研究證實(shí),高TSH與甲狀腺功能減退的小鼠骨骼發(fā)育異常有關(guān),然而其細(xì)胞機(jī)制仍不清楚。本研究旨在探討:TSH能否不依賴甲狀腺激素獨(dú)立作用于軟骨細(xì)胞,即TSH刺激對軟骨細(xì)胞增殖和分化的直接影響以及自噬在該過程中的可能作用。方法1.小鼠原代軟骨細(xì)胞(PMCs)的培養(yǎng)及處理:取小鼠膝關(guān)節(jié),去除周圍結(jié)締組織,將軟骨組織與深層軟骨下骨仔細(xì)分離,緩沖液沖洗,剪碎軟骨組織后用0.1%膠原酶消化18.5 h,離心去上清,依次經(jīng)100μm和40μm濾網(wǎng)過濾。洗滌后用含10%胎牛血清(FBS)、1%雙抗和100μM維生素C的培養(yǎng)液分散培養(yǎng)。隔天換液,待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時,換成含1%FBS的培養(yǎng)基分別以不同處理培養(yǎng)48h,盡可能減少血清中脂蛋白及各種激素對實(shí)驗(yàn)的干擾作用。2.用10 mU/ml bTSH處理PMCs特定的時間,設(shè)置對照組。用CCK8和EdU試劑盒檢測細(xì)胞增殖活性。3.用JC-1檢測細(xì)胞線粒體膜電位的改變來觀察細(xì)胞凋亡情況。應(yīng)用Western blot檢測促凋亡因子Bax和Bcl-2的表達(dá)水平。4.用Western blot和免疫熒光染色檢測自噬相關(guān)標(biāo)志物如LC3、Beclin-1和p62,Western blot mTOR、p-AMPK和AMPK,用透射電鏡檢測PMCs的自噬情況。5.采用Alcian blue染色檢測亞甲減小鼠和正常小鼠軟骨蛋白聚糖的表達(dá)水平。通過免疫熒光染色檢測collagen ll和collagen l的表達(dá)情況。6.通過RT-PCR檢測不同整合素亞基的表達(dá)情況。結(jié)果1.CCK-8細(xì)胞增值活性檢測發(fā)現(xiàn),細(xì)胞活性在高濃度TSH(10 mU/ml)刺激24h后下降明顯,低濃度組(1 mU/ml)在TSH刺激72h后,細(xì)胞增殖活性也比對照組產(chǎn)生顯著降低(P0.05),并持續(xù)下降。EdU細(xì)胞增殖檢測結(jié)果也表明,10mU/mlTSH刺激48h顯著降低PMCs增殖能力(P0.01),對照組有增值活性的細(xì)胞百分比為TSH刺激組的6倍。2.流式結(jié)果顯示,TSH刺激增加線粒體膜電位的去極化,細(xì)胞發(fā)生凋亡。通過Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證,TSH刺激使促凋亡因子BAX蛋白表達(dá)增加(P0.01),Bcl-2表達(dá)水平降低(P0.01),Bcl-2與BAX蛋白表達(dá)水平的比值降低(P0.05)。3.TSH刺激降低軟骨細(xì)胞自噬水平。Western blot檢測結(jié)果表明,LC3 11(P0.05)和Beclin-1(P0.01)的表達(dá)水平降低,且在免疫熒光試驗(yàn)的結(jié)果中得到了驗(yàn)證。透射電鏡也得出相同結(jié)論。4.Western blot和免疫熒光檢測得出TSH刺激使p62表達(dá)水平明顯增加的結(jié)論。免疫共聚焦結(jié)果顯示,高表達(dá)p62的細(xì)胞伴隨有凋亡的細(xì)胞核,表明TSH刺激抑制自噬,可能進(jìn)一步誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。5.Western blot檢測發(fā)現(xiàn)mTOR/AMPK通路在TSH刺激后產(chǎn)生損傷,提示TSH可能通過損傷自噬上游的mTOR/AMPK通路,從而抑制自噬水平。6.TSH抑制2型膠原蛋白和蛋白聚糖的合成,同時伴隨整合素亞基表達(dá)形式的變化。結(jié)論1.TSH刺激抑制軟骨細(xì)胞增殖,增加Bcl-2信號介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。2.TSH刺激自噬標(biāo)志物beclin-1和LC3II的表達(dá)減少,伴隨p62累積而抑制自噬潮。3.TSH抑制collagen 11和蛋白聚糖的合成,改變整合素亞基的表達(dá),加速軟骨細(xì)胞分化過程。
[Abstract]:Objective To study the subclinical hypothyroid function (SCH), which is a common endocrine and metabolic disorder in the clinic. Although the thyroid hormone level is in the normal range, the level of the thyroid stimulating hormone (TSH) in the serum is raised and the normal reference range is deviated. It has been demonstrated that high TSH is associated with an abnormal bone development in a mouse with hypothyroid function, but its cellular mechanism remains unclear. The purpose of this study is to investigate whether TSH does not depend on the independent effect of thyroid hormone on the chondrocytes, that is, the direct effect of TSH stimulation on the proliferation and differentiation of the chondrocytes and the possible effects of autophagy in the process. Method 1. Culture and treatment of mouse primary chondrocyte (PMCs): taking the knee of the mouse, removing the surrounding connective tissue, carefully separating the cartilage tissue from the subchondral bone, washing the buffer solution, and digesting the cartilage tissue with 0.1% collagenase for 18-5 h, and centrifuging to remove supernatant. The filter is filtered through a filter screen of 100. m u.m and 40. m After washing, the culture was dispersed with a culture solution containing 10% fetal bovine serum (FBS), 1% double anti-and 100.mu. M vitamin C. when the cell fusion degree reaches 70-80%, the culture medium with 1% FBS is used for culturing for 48hr in different treatment, so as to minimize the interference effect of the lipoprotein and various hormones on the experiment in the serum. The specific time of the PMCs was treated with 10 mU/ ml of bTSH and the control group was set. Cell proliferation activity was tested with the CCK8 and the EdU kit. The changes of mitochondrial membrane potential of the cells were detected by JC-1 to observe the cell apoptosis. The expression level of the pro-apoptotic factor Bax and Bcl-2 was detected by Western blot. The autophagy of PMCs was detected by Western blot and immunofluorescence staining, such as LC3, Beclin-1 and p62, Western blot mTOR, p-AMPK and AMPK. The expression level of subungual and normal mouse cartilage proteoglycans was detected by Alcian blue staining. The expression of the collection 11 and the collection l was detected by immunofluorescence staining. The expression of different integrin subunits was detected by RT-PCR. Results 1. The value-added activity of CCK-8 cells showed that the cell activity decreased after the stimulation of high-concentration TSH (10 mU/ ml) for 24h, and the cell proliferation activity was significantly lower in the low-concentration group (1 mU/ ml) than in the control group (P0.05). The results of the proliferation of EU cells also showed that the proliferation ability of PMCs was significantly reduced by the stimulation of 10mU/ ml of TSH (P 0.01), and the percentage of cells with value-added activity in the control group was 6times that of the TSH stimulation group. The results showed that the stimulation of TSH increased the depolarization of the mitochondrial membrane potential and the apoptosis of the cells. The results of Western blot showed that the expression of the pro-apoptotic factor BAX protein was increased (P0.01), the level of Bcl-2 expression was decreased (P0.01), and the ratio of Bcl-2 to BAX protein expression was decreased (P0.05). The results of Western blot showed that the expression level of LC3 11 (P0.05) and Beclin-1 (P0.01) was reduced, and the results of the immunofluorescence test were verified. The same conclusion was also obtained by transmission electron microscope. The results showed that the cells with high expression of p62 were accompanied by apoptotic nuclei, indicating that TSH stimulation inhibited autophagy and could further induce apoptosis. 5. Western blot showed that the mTOR/ AMPK pathway was damaged after the stimulation of TSH, suggesting that the TSH may pass through the mTOR/ AMPK pathway upstream of the autophagy. 6. TSH inhibits the synthesis of type 2 collagen and proteoglycan, and is accompanied by the change of the expression of integrin subunit. Conclusion 1. TSH stimulates the proliferation of chondrocytes and increases the apoptosis of Bcl-2 signaling.
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R684.3

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本文編號：2423174