【摘要】：背景和目的嚴重的創(chuàng)傷或某些疾病可以導致關節(jié)軟骨損傷,發(fā)生一系列病理變化,并造成關節(jié)軟骨不可逆的退行性改變,最終引發(fā)骨關節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)。據世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計,60歲以上人群中約有50%患病,75歲以上人群中的OA發(fā)病率高達80%。目前全世界OA患者有3.6億人,國內最新統(tǒng)計資料調查顯示,我國骨關節(jié)炎患者已達1.2億。據美國統(tǒng)計,每年應用于骨關節(jié)炎治療方面的花費大約為5.46億美元,同時每年至少要進行50萬例的關節(jié)成形手術。OA的發(fā)病通常還伴有關節(jié)疼痛,對患者的正常生活產生重大影響。在病情嚴重時甚至可能導致肢體殘疾,大大降低患者的生活質量,該病的最終致殘率為53%,故有“頭號致殘疾病”之稱。由于關節(jié)軟骨的解剖結構較為特殊,其周圍沒有血管和神經的支配,因此一旦發(fā)生損傷就難以進行自我的修復。因此深入研究對軟骨損傷的修復機制具有重要的臨床價值和社會意義。隨著近些年來組織工程技術的飛速發(fā)展和不斷創(chuàng)新,組織工程軟骨逐漸成為一種理想的軟骨損傷的新型修復方式。其中,組織工程軟骨的細胞來源及誘導方法等問題一直是軟骨組織修復領域研究的關鍵。間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)被認為是目前利用組織工程進行軟骨構建過程中的一類非常理想的種子細胞,其具有來源廣泛、低免疫原性,具有高度的多向分化潛能以及在體外進行多代增殖和培養(yǎng)后仍能夠保持原有細胞形態(tài)和生理功能等諸多優(yōu)勢。但是,有研究發(fā)現,體外培養(yǎng)的MSCs在成軟骨分化的后期,并不會分泌大量的細胞外基質進而形成關節(jié)軟骨,而是繼續(xù)分化為沒有修復作用的肥大化軟骨細胞,并最終形成無功能的纖維化軟骨或者鈣化。因此,如何抑制MSCs來源的軟骨細胞向肥大化軟骨細胞的分化,并使其保持軟骨細胞的相應表型和特性,成為軟骨組織工程研究面臨的一個重要問題。軟骨的形成過程以及軟骨組織生物學功能的發(fā)揮,這些過程都是通過骨形成蛋白及相關的轉錄因子和信號通路等多種因子綜合調控的結果,同時這些調控因子形成復雜的調控網絡。近年來的研究表明,細胞內的微小RNA(micro RNA,縮寫為mi RNA)在軟骨細胞分化以及生物學功能發(fā)揮的過程中起著關鍵性的調控作用。在眾多的mi RNA中,miR-29b可以正向調節(jié)骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,bmscs)的成骨分化。已有研究證實,組蛋白去乙�；�4(histonedeacetylase4,hdac4)是mir-29b的下游靶基因之一。另外,hdac4可以通過降低軟骨細胞肥大化的標志基因runx2的表達,從而抑制軟骨細胞肥大化。由此,我們推測mir-29b很可能通過調節(jié)其下游的hdac4來影響bmscs成軟骨細胞分化的過程,使之向肥大化的軟骨細胞分化。本研究應用mir-29b過表達和mir-29b抑制技術,針對這一可能調控過程及機制進行了相應的實驗研究。材料與方法在課題組已建立的mscs軟骨肥大化誘導體系的基礎上,本研究對mir-29b在mscs成軟骨分化過程中的作用及其機制進行探討。一、采用已建立mscs軟骨肥大化誘導體系培養(yǎng)細胞團。番紅o固綠染色法檢測細胞團的硫酸軟骨素的表達情況,確定體外成軟骨肥大化誘導成功與否。并分別取3、7、14、21、28d的細胞團,采用rt-pcr檢測colii、colx、runx2、sox9、hdac4和mir-29b的mrna的表達情況。二、在前一部分研究的基礎上進行mir-29b干預mscs成軟骨肥大化的實驗。實驗分組包括:①過表達組,轉染pre-mir-29b;②過表達對照組,轉染negativecontrol;③抑制組,轉染antagomir-29b;④抑制對照組,轉染antagomir-29bcontrol。所有實驗組均于細胞誘導的第10d進行首次轉染,然后每間隔2d進行補充轉染。分別取誘導培養(yǎng)至第14d、21d和28d的軟骨細胞,用rt-pcr的方法檢測mir-29b在過表達和抑制表達的情況下對軟骨肥大化的相關基因colii、colx、sox9、mmp13、runx2等的mrna表達的影響。運用番紅o固綠染色法檢測抑制組軟骨細胞中硫酸軟骨素分泌情況。利用免疫組化和westernblot方法,從蛋白水平證實mir-29b在軟骨肥大化的調控作用。結果一、番紅o固綠染色法發(fā)現,與對照組相比,肥大化組的軟骨細胞硫酸軟骨素分泌減少,尤其在誘導28d時差異顯著(p0.05),顯示體外誘導肥大化成功。軟骨標志性基因coliimrna的表達:成軟骨階段呈上升趨勢,肥大化階段呈下降趨勢(p0.05);肥大化相關基因colxmrna表達:成軟骨階段表達量較低,肥大化階段顯著升高(p0.05)。runx2和mir-29b的表達量在成軟骨階段水平較低,在軟骨細胞肥大化的階段則顯著上升(p0.05);相反,sox9的表達在成軟骨階段上升,而處于肥大化階段的細胞中表達下降(p0.05)。據此,我們認為下調mir-29b的表達水平可延緩或阻斷mscs來源的軟骨細胞的肥大化進程。二、利用mi R-29b干預MSCs向成軟骨細胞肥大化的方向分化,實驗結果顯示:在mi R-29b過表達組,軟骨分化的相關基因Col II、HDAC4和Sox9的m RNA表達較對照組顯著降低(P0.05),而軟骨肥大化的相關基因Col X、MMP13和Runx2的mRNA表達顯著升高(P0.05);在抑制mi R-29b表達組中則相反,軟骨細胞肥大的相關基因表達較對照組顯著降低(P0.05),而軟骨分化相關基因的表達則會顯著升高(P0.05)。在番紅O固綠染色實驗中,抑制mi R-29b的細胞細胞外基質的分泌量較對照組顯著增多。在免疫組化實驗中,抑制mi R-29b的實驗組X膠原的表達量較高。Western blot實驗檢測結果顯示:mi R-29b過表達組的Col II、HDAC4和Sox9蛋白水平顯著升高(P0.05),Col X、Runx2的mRNA表達顯著下降(P0.05);而抑制miR-29b表達組中各蛋白的表達情況則與過表達組相反。結論mi R-29b為軟骨細胞肥大化的正性調控因子,mi R-29b能促進軟骨細胞肥大化進程,抑制miR-29b可延緩軟骨細胞肥大化進程。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R684

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本文編號：2405363