【摘要】：【背景】人游離皮瓣移植越來越廣泛應用于修復嚴重創(chuàng)傷和腫瘤等造成的皮膚軟組織缺損,目前游離皮瓣的存活率仍然只有95%。以往的研究認為影響皮瓣存活的因素很多,其中皮瓣缺血再灌注損傷是影響皮瓣的存活的一個重要的因素。確保游離皮瓣完全存活,提高皮瓣存活率是整形醫(yī)生首要目標。研究者們發(fā)現通過藥理學和機械的干預能夠減輕再灌注損傷,但是藥物干預在臨床上的運用仍然受到限制�！叭毖筇幚怼睘殚L期缺血后以及再灌注之前進行的一系列的機械重復周期短暫的再灌注和再阻斷血流循環(huán)。目前,缺血后處理的保護作用已經在家兔、大鼠的游離皮瓣得到證實;但是還未有人的皮瓣相關的研究,并且后處理的保護作用研究機制并不清楚。本研究是想通過建立人皮瓣微血管內皮細胞低氧后處理模型,模擬在體的缺血后處理,研究缺血后處理的保護作用,為具體的機制研究奠定基礎�！灸康摹繀⒖紘鴥韧馄ぐ暾嫫の⒀軆绕ぜ毎崛》椒�,采用酶消化加磁珠分選的方法提取人皮瓣微血管內皮細胞。確定低氧后處理的最佳的缺氧和復氧時間,建立低氧后處理模型�！痉椒ā坎捎妹赶�(lián)合磁珠分選法得到人真皮微血管內皮細胞(HDMECs),體外培養(yǎng)傳至P5代,采用Ⅷ因子免疫熒光及CD309、CD34流式細胞學進行鑒定;檢測乳酸脫氫酶(LDH)在隨缺氧時間含量的變化;Tunel法染色計算各組的細胞凋亡率;用Western Blot的方法檢測Bcl-2、Bax和Caspase-3以及活化Caspase-3的蛋白含量表達�！窘Y果】1.細胞分離培養(yǎng)4d后,可見散在的細胞集落,周邊有成纖維狀細胞生長,細胞集落,生長7d后,可見細胞呈鋪路石樣排列;2.經第2次分選,可見細胞呈緊密排列的漩窩狀或同心圓狀外觀,呈鋪路石樣排列。第二次CD31磁珠分選后陽性率95%;3.二次CD31磁珠分選后流式細胞鑒定結果:CD309陽性率為(95.4±1.34)%;CD34陽性率為(42.5±3.23)%;4.免疫熒光檢測上清液中LDH:結果LDH隨著缺氧時間的增加而加,8h與0h、2h、4h、6h相比LDH含量顯著增加p0.05,8h與12h差異性不顯著p0.05;5.Tunel和Western結果顯示2min*3s和5min*3s的缺氧后處理(hypoxic postconditioning,H-post C)能夠起到保護作用;【結論】1.根據細胞的集落形態(tài)以及免疫熒光和流式的結果分析得出,消化酶加CD31磁珠分選真皮微血管內皮細胞(HDECMs)的辦法穩(wěn)定可靠;2.根據乳酸脫氫酶(LDH)隨缺氧時間變化的結果,確定最佳的缺氧時間;3.通過Tunel凋亡染色檢測細胞凋亡比率;蛋白免疫印跡(Western Blot,WB)檢測Bax、Bcl-2和活化的Caspase-3、Caspase-3蛋白含量的表達,建立了人真皮微血管內皮細胞的低氧后處理模型,其中2min*3s和5min*3s是最好的后處理循環(huán)次數和持續(xù)時間�！居懻摗勘狙芯砍晒Φ牟捎肅D31磁珠分選的方法提取并培養(yǎng)了HDMECs,采用Ⅷ因子免疫熒光進行鑒定,初步證實為HDMECs;同時采用CD34和CD309流式抗體檢測細胞的生物學特征,這樣能更方便我們在體外研究HDMECS的生理和病理生理特征。根據WB和Tunel結果分析我們同樣發(fā)現,單純低氧8h/復氧24h,活化的caspase-3/caspase-3、Bax/Bcl-2以及細胞凋亡的比例高于其他組。并且2min*3s和5min*3s的缺氧后處理能夠抑制細胞凋亡,但是在10min*3s、20min*3s缺氧后處理并不能達到理想的保護作用。因此我們推測在皮瓣微血管內皮細胞中,適當的后處理時間能夠通過降低Bax/Bcl-2,活化的caspase-3/caspase-3的比例,達到抑制細胞凋亡的作用。所以說我們成功的建立了人真皮微血管內皮細胞的低氧后處理模型。
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【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R622

【參考文獻】

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1 ;Preconditioning and postconditioning reduce hepatic ischemia-reperfusion injury in rats[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2009年06期

2 胡大海,陳璧,湯朝武,韓軍濤,姜篤銀,蘇映軍,朱雄翔,賈赤宇,徐明達;人真皮微血管內皮細胞的體外分離和原代培養(yǎng)[J];西北國防醫(yī)學雜志;1999年04期

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本文編號：2400046