【摘要】：背景肝臟移植是目前治療終末期肝臟疾病最有效的治療選擇。但移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生造成的移植物失功仍未得到理想的解決。受困于供體肝來源緊缺的國際大環(huán)境,更使得如何誘導(dǎo)移植術(shù)后移植肝特異性免疫耐受一直是移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)及重點(diǎn)。我們的團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn),Kupffer細(xì)胞(KCs)作為體內(nèi)具有高效抗原呈遞功能的巨噬細(xì)胞群,在術(shù)后誘導(dǎo)移植肝臟免疫耐受中起著雙重效應(yīng),但其確切機(jī)制目前尚不清楚�？赡芘c誘導(dǎo)Th亞群細(xì)胞間動態(tài)平衡以及自身極化有關(guān)。新近發(fā)現(xiàn)肌醇酶1-X盒連接蛋白1(Inositol Requiring 1-X Box Binding Protein1,IRE1-XBP1)通路不僅參與了非折疊蛋白反應(yīng)(Unfold Protein Response, UPR),還對抗原呈遞細(xì)胞(Antigen Presenting Cells, APCs)的功能具有調(diào)節(jié)作用,但并未涉及肝移植領(lǐng)域。因此探索KCs中IRE1-XBP1通路活性在移植肝免疫反應(yīng)中的作用與機(jī)制,可能為臨床實(shí)踐提供新的靶點(diǎn)以及理論依據(jù)。第一部分IRE1-XBP1對Kupffer細(xì)胞功能的調(diào)控及對初始T淋巴細(xì)胞功能和分化的影響目的分離、培養(yǎng)LEWIS大鼠肝臟KCs,通過抑制或上調(diào)KCs中IRE1-XBP1活性,觀察這一通路對KCs功能的調(diào)控及其對初始T淋巴細(xì)胞功能及分化的作用機(jī)制。方法①采�、粜湍z原酶消化肝臟聯(lián)合非連續(xù)梯度離心法分離Lewis大鼠KCs；②免疫組化、激光共聚焦分別檢測KCs表面CD68和CD163的表達(dá)來鑒定KCs；③吞墨以及吞熒光乳膠顆粒實(shí)驗(yàn)來判斷KCs的吞噬能力；臺盼藍(lán)染色鑒定KCs的活性。鑒定后的KCs隨機(jī)分為四組：XBP1抑制組(XBP1-shRNA group);錯(cuò)義序列沉默對照組(Scrambled-shRNA group, Ctrl-shRNA); XBP1過表達(dá)組(AdV-XBP1 group);錯(cuò)義序列過表達(dá)對照組(AdV-Scrambled group, Ctrl-AdV);④熒光顯微鏡下以及激光共聚焦檢測法評估質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率；⑤RT-PCR以及Western Blot檢測各組KCs中XBPKIL-6. IFN-γ、TNF-α、IL-17、JAK1、JAK2、STAT1以及STAT3的基因及蛋白表達(dá)水平；⑥流式細(xì)胞術(shù)(FCM)以及激光共聚焦檢測各組KCs表型的變化情況；⑦ELISA檢測KCs自分泌IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17的水平；⑧分離大鼠脾臟淋巴細(xì)胞,尼龍毛柱過濾純化T細(xì)胞,FCM檢測純度,與上述各組KCs共培養(yǎng),MTT法及Brdu滲入法檢測T細(xì)胞增殖情況；⑨Annexin V/PI法FCM觀察T淋巴細(xì)胞凋亡情況；⑩ELISA測定上清液中IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17及IL-10含量。結(jié)果①KCs細(xì)胞表面CD68和CD163呈強(qiáng)陽性及強(qiáng)熒光強(qiáng)度表達(dá),提示我們提取的是大鼠的KCs。吞噬實(shí)驗(yàn)以及臺盼藍(lán)染色提示分離培養(yǎng)的KCs具有良好的吞噬能力及活性；②轉(zhuǎn)染XBP1的沉默質(zhì)粒以及過表達(dá)質(zhì)粒后,6h開始零星出現(xiàn)熒光表達(dá),48小時(shí)前后達(dá)到高峰,2w后開始逐漸下降；RT-PCR以及WB結(jié)果顯示,XBP1沉默組中XBP1的表達(dá)量較對照組顯著降低,而在XBP1過表達(dá)組則明顯上調(diào)；③FCM以及激光共聚焦術(shù)發(fā)現(xiàn),XBP1沉默組中MHC-Ⅱ、IICD86、CD40的表達(dá)明顯低于對照組,而CD204和CD206的表達(dá)則顯著高于對照組；而在XBP1過表達(dá)組,則呈相反趨勢；④WB檢測發(fā)現(xiàn)XBP1沉默組中JAK1JAK2、STAT1和STAT3的蛋白表達(dá)及其磷酸化水平均受到抑制,而在XBP1過表達(dá)組則上述蛋白的表達(dá)及磷酸化水平得到顯著增強(qiáng)；⑤FCM檢測T細(xì)胞純度為78.73±4.35%,其中CD4+為58.84±10.47%,CD4+/CD8+T細(xì)胞比例為2.95。和各組KCs共培養(yǎng)3d后,發(fā)現(xiàn)抑制KCs中IRE1-XBP1活性后T細(xì)胞增殖受到明顯抑制,凋亡增加,促炎細(xì)胞因子分泌減少,抗炎細(xì)胞因子分泌增加(P0.05),而上調(diào)KCs中IRE1-XBP1活性后T細(xì)胞增殖則明顯增強(qiáng),凋亡明顯減少,促炎細(xì)胞因子(FN-γ、TNF-α)分泌增加,抗炎細(xì)胞因子(IL-10)分泌減少(P0.05)。結(jié)論①KCs中IRE1-XBP1通路活性變化可以轉(zhuǎn)化KCs的極性狀態(tài),并通過調(diào)節(jié)JAK-STAT家族成員表達(dá),調(diào)控KCs自分泌細(xì)胞因子的組成成分；②KCs中IRE1-XBP1通路活性變化可以影響共培養(yǎng)初始T淋巴細(xì)胞的增殖分化、凋亡以及相關(guān)細(xì)胞因子的分泌。第二部分大鼠原位肝移植急性排斥模型建立和攜XBP1-shRNA質(zhì)粒的脂質(zhì)包裹液態(tài)氟碳納米粒靶向轉(zhuǎn)染Kupffer細(xì)胞的效果評估目的建立LEWIS-BN大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)模型,用攜帶XBP1-shRNA的脂質(zhì)包裹氟碳納米粒(perfluorocarbonnanoparticles,PFCN)與XBP1-shRNA'漫病毒分別轉(zhuǎn)染上述急性排斥反應(yīng)模型,評價(jià)兩種不同轉(zhuǎn)染載體對KCs靶向性干擾的高低。方法采用改良Kamada"雙套管”法建立LEWIS-BN大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)模型；采用兩步乳化法制作脂質(zhì)包裹的PFCN乳液,通過正負(fù)電荷連接XBP1-shRNA質(zhì)粒。(1)XBP1-sRNA-PFCNP組：經(jīng)門靜脈注射XBP 1-shRNA-PFCNP(1 ml/1000g),1×109Tu/mL,再推注2mL生理鹽水；(2)XBP 1-shRNA-Lentivirus組：經(jīng)門靜脈注射XBP 1-shRNA-Lentivirus 2mL, 1×109Tu/mL;(3)對照組：經(jīng)門靜脈推注生理鹽水2mL。觀察轉(zhuǎn)染后3天及7天KCs、肝細(xì)胞、脾臟及小腸中XBP1的表達(dá)改變。結(jié)果①PFH以1：8的比例、聲震時(shí)間80s得到性質(zhì)穩(wěn)定的平均粒徑為283.78±23.16的PFCN;成功建立穩(wěn)定的LEWIS-BN大鼠原位肝移植模型；②RT-PCR與WB結(jié)果提示：術(shù)后第3d, PFCN組及慢病毒組均能有效抑制KCs中XBP1的表達(dá),抑制效率未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；同時(shí)兩種方式對肝細(xì)胞及小腸內(nèi)XBP1也有抑制作用,但慢病毒組抑制程度明顯高于PFCN組；③術(shù)后7d,慢病毒組對KCs中XBP1的抑制程度明顯弱于PFCN組,而對肝細(xì)胞內(nèi)XBP1的抑制作用則明顯強(qiáng)于PFCN組;PFCN組對脾和小腸的影響與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而慢病毒組則持續(xù)抑制,但抑制率較3d時(shí)減弱。結(jié)論LEWIS-BN是一種穩(wěn)定的大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)模型；采用改良”雙套管”法能穩(wěn)定高效的構(gòu)建這一模型；攜帶XBP1-shRNA的PFCN作為轉(zhuǎn)染載體,較慢病毒經(jīng)由門靜脈高壓注射轉(zhuǎn)染,具有更高的KCs靶向性以及抑制效率。第三部分阻斷Kupffer細(xì)胞中IRE1-XBP1通路活性誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究目的觀察阻斷移植肝KCs中IRE1-XBP1通路活性對大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)模型的作用及機(jī)制。方法①采取改良"Kamada"雙套管法建立LEWIS-BN大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)模型；②受體隨機(jī)分為三組：生理鹽水組(NS),錯(cuò)義序列沉默對照組(Scrambled-shRNA group, Ctrl-shRNA)和沉默組(XBP1-shRNA),劑量參考第二部分。③觀察術(shù)后7天各組受體生存時(shí)間與肝功能變化；移植肝病理改變；④TUNEL檢測移植區(qū)細(xì)胞凋亡情況；⑤ Real-time PCR檢測肝組織中T-bet、RORγt、 IFN-γ、IL-17及IL-10mRNA表達(dá)水平；Western Blot檢測移植肝中CD40、CD86、CD204、CD206、IFN-γ、IL17及幾-10蛋白表達(dá)水平；⑥ELISA檢測外周血中IFN-y. IL-17和IL-10的表達(dá)水平。結(jié)果①術(shù)后第7天,沉默組受體存活時(shí)間以及肝功能較其余兩組得到明顯的改善(P0.05); RAI評分屬輕度排斥反應(yīng),其余兩組呈重度排斥反應(yīng)。TUNEL顯示沉默組匯管區(qū)淋巴細(xì)胞凋亡程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組以及生理鹽水組。②沉默組中T-bet、RORyt、IFN-γ、IL-17的mRNA相對表達(dá)量均明顯低于對照組以及生理鹽水組(P0.05)。而IL-10的含量則高于其余兩組(P0.05)。③沉默組中CD40、CD86、 IFN-y、IL-17的蛋白表達(dá)明顯減弱,而CD204、CD206和IL-10的蛋白水平則較其余兩組明顯上調(diào)(P0.05)。④ ELISA結(jié)果提示隨著移植后時(shí)間的推移,沉默組外周血清中IFN-γ、IL-17的表達(dá)量與對照組以及生理鹽水組比較,逐漸降低(P0.05)；而IL-10的表達(dá)則逐漸增加(P0.05)。結(jié)論體內(nèi)阻斷KCs中IRE1-XBP1通路能顯著減輕AcR對肝臟組織的破壞程度并誘導(dǎo)免疫耐受形成；其機(jī)制可能與誘導(dǎo)活化M1樣KCs向M2樣KCs轉(zhuǎn)化,并使KCs分泌細(xì)胞因子性質(zhì)從促進(jìn)炎癥反應(yīng)型向移植免疫反應(yīng)類型變化,進(jìn)而誘導(dǎo)Th1/Th17向Th2/Treg免疫偏倚密切相關(guān)相關(guān)；
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R657.3

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本文編號：2396447