【摘要】：目的:觀察人表皮干細(xì)胞和已分化的角質(zhì)形成細(xì)胞中l(wèi)ncRNA和mRNA的差異表達(dá)及其相關(guān)性,初步探索lncRNA作為競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)參與調(diào)控表皮干細(xì)胞的自我更新及分化,獲得更多有關(guān)表皮干細(xì)胞體外復(fù)制、擴增和分化調(diào)控的新信息,為組織工程構(gòu)建皮膚提供更理想的種子細(xì)胞來源,為未來創(chuàng)面愈合的基因治療提供線索。方法:(1)取泌尿外科行包皮環(huán)切術(shù)患者的正常包皮組織,采用酶消化法和Ⅳ型膠原快速貼壁法獲得A組人表皮干細(xì)胞、B組角質(zhì)形成細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞的生長狀況,免疫細(xì)胞化學(xué)染色法行β1整合素、CK1、CK10、CK19單抗檢測鑒定。用Trizol一步法分別提取2組細(xì)胞總RNA并質(zhì)檢,純化后進(jìn)行熒光標(biāo)記、芯片雜交,然后掃描得到雜交圖片,利用軟件提取數(shù)據(jù)并行差異性分析,同時應(yīng)用RT-PCR法驗證芯片結(jié)果的可靠性。對差異表達(dá)的蛋白編碼基因行GO分析和Pathway分析。(2)結(jié)合以往文獻(xiàn)報道,通過UCSC在線軟件對本試驗中表皮干細(xì)胞中差異表達(dá)Lnc RNA進(jìn)行整合,歸納總結(jié)出差異表達(dá)的反義鏈型lncRNA、正義鏈型lncRNA、增強型lncRNA及基因間lncRNA。接著利用BLAST在線軟件檢測差異表達(dá)的外顯子正義鏈型lncRNA和其鄰近差異表達(dá)蛋白編碼基因的堿基相似性,以尋找可能的競爭性內(nèi)源性lncRNA,結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)NR_073046和NR_045013分別與鄰近蛋白編碼基因序列高度相似,故借助靶基因預(yù)測軟件Targetscan及miRanda分別對其可能結(jié)合的靶mi RNA進(jìn)行預(yù)測,以進(jìn)一步預(yù)測這兩個lncRNA的競爭性結(jié)合機制。除此以外,計算4個異常表達(dá)的lncRNA和mRNA的皮爾森系數(shù),以相關(guān)系數(shù)的絕對值大于0.99且P值小于0.001為閾值,尋找共表達(dá)lncRNA-mRNA對,并構(gòu)建了lncRNA-mRNA共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖,并對差異lncRNA靶基因進(jìn)行了GO分析及Pathway分析,以更好地驗證lncRNA與m RNA的相關(guān)性。結(jié)果:(1)快速黏附于Ⅳ型膠原的A組細(xì)胞培養(yǎng)3 d能形成明顯克隆,免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示β1整合素及CK19呈陽性表達(dá),符合表皮干細(xì)胞特征;不能快速黏附于Ⅳ型膠原的B組細(xì)胞培養(yǎng)3 d無明顯克隆形成,CK1及CK10呈陽性表達(dá),符合角質(zhì)形成細(xì)胞的特征。提取兩組細(xì)胞總RNA質(zhì)檢合格后篩選出3720條lncRNA和4069條mRNA有差異性表達(dá),其中2292條lncRNA明顯上調(diào),1428條lncRNA明顯下調(diào),1248條mRNA明顯上調(diào),2821條mRNA明顯下調(diào),RT-PCR驗證結(jié)果與芯片檢測結(jié)果具有較好的一致性,且GO分析條目涵蓋增殖、生長、凋亡等條目。(2)對差異表達(dá)的lncRNA行亞類分析,發(fā)現(xiàn)其中有165條反義鏈型lncRNA,759條外顯子正義鏈型lncRNA,293條增強型lncRNA以及768條基因間型lncRNA。緊接著對外顯子正義鏈型lncRNA行堿基相似性分析發(fā)現(xiàn)15條lncRNA與鄰近蛋白編碼基因相似基序列達(dá)到90%以上,其中差異表達(dá)NR_073046和NR_045013分別與鄰近蛋白編碼基因DEDD2和LMO3的相似序列達(dá)到100%。進(jìn)一步的靶miRNA預(yù)測,發(fā)現(xiàn)NR_073046可與DEDD2競爭性互補配對結(jié)合432條miRNA,其中有10條miRNA為高度互補配對且相對保守,比如miR-204-5P/211-5p,NR_045013可與LMO3競爭性互補配對結(jié)合960條miRNA,其中有62條miRNA是高度互補配對且相對保守,比如miR-200a-3p/141-3p,miR-489-3p,miR-199-5p,而且lncRNA-mRNA共表達(dá)分析表明NR_073046和NR_045013分別與DEDD2和LMO3的表達(dá)存在相關(guān)性。結(jié)論:(1)體外培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞lncRNA與mRNA表達(dá)譜存在明顯差異,這可能與兩者不同的增殖分化能力等生物學(xué)特性有關(guān)。(2)差異表達(dá)的NR_073046和NR_045013可能通過競爭性內(nèi)源性機制結(jié)合miRNA,分別調(diào)控相應(yīng)蛋白編碼基因DEDD2和LMO3的表達(dá),從而參與表皮干細(xì)胞的自我更新及分化,為創(chuàng)面愈合的治療提供了新的理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: To observe the differential expression and correlation of lncRNA and mRNA in human epidermal stem cells and differentiated keratinocytes, and to explore the self-renewal and differentiation of lncRNA as a competitive endogenous RNA (cRNA) in the control of epidermal stem cells, and to obtain more in vitro replication of epidermal stem cells. The new information of the regulation of amplification and differentiation provides a more ideal source of seed cell for the construction of the skin of the tissue engineering, and provides a clue for gene therapy of the wound healing in the future. Methods: (1) The normal prepuce tissue of the patients with prepuce circumcision was taken, and the human epidermal stem cells and B-group keratinocytes were obtained by the method of enzyme digestion and the rapid adherence of type 鈪，

本文編號：2394597