【摘要】：一、研究背景:近年來,四肢大段骨缺損的修復(fù)重建取得了巨大進步,但仍然是困擾骨科醫(yī)生的主要難題之一,理想的治療目標不僅要實現(xiàn)骨缺損的快速愈合,同時要減少對患者的不利影響,最后恢復(fù)患肢的功能。目前經(jīng)典的重建方法包括自體松質(zhì)骨移植,Ilizarov技術(shù)以及帶血管腓骨移植技術(shù),這些方法在四肢骨缺損修復(fù)重建過程中取得了巨大的成功,至今仍發(fā)揮著不可或缺的作用,但這幾種骨重建技術(shù)存在一定的局限性仍需要改進。自體松質(zhì)骨移植僅適用于修復(fù)4-6cm以內(nèi)的骨缺損,否則移植骨可能被吸收導(dǎo)致骨重建失敗。骨搬移技術(shù)治療周期較長,患肢佩戴大體積的外固定架對患者的日常生活影響較大,治療過程極為痛苦,患者不易耐受。帶血管腓骨移植技術(shù)對修復(fù)大段骨缺損具有一定優(yōu)勢,但是對設(shè)備和技術(shù)要求較高,還容易出現(xiàn)骨連接不正、骨延遲愈合或不愈合、供骨區(qū)和受骨區(qū)同時失敗的風險和并發(fā)癥[1-3]。2000年Masquelet等[4]報道了膜誘導(dǎo)技術(shù)治療四肢節(jié)段性骨缺損,因為具有成功率高、并發(fā)癥少、操作簡單等優(yōu)勢逐步被越來越多的骨科醫(yī)師所認可。該技術(shù)治療骨缺損主要通過兩期手術(shù)完成,首先對骨缺損及周圍清創(chuàng),去除感染、壞死的組織,局部填塞聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl Methacrylate PMMA)骨水泥誘導(dǎo)周圍形成一層具有生物活性的膜,稱為誘導(dǎo)膜,二期(6-8周后)在膜內(nèi)植入顆粒狀自體松質(zhì)骨修復(fù)骨缺損。早期研究顯示該技術(shù)修復(fù)骨缺損成功率高達88%~100%,能夠成功修復(fù)長達25cm的骨缺損[5-7]。目前認為膜誘導(dǎo)技術(shù)治療四肢骨缺損成功率高的關(guān)鍵因素是骨水泥誘導(dǎo)形成的生物膜,它不僅能維持移植骨的形態(tài),防止移植骨被周圍組織吸收,同時能為移植骨成骨提供必須的血供及多種成骨生長因子,包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)等[5]。誘導(dǎo)膜能夠促進自體松質(zhì)骨修復(fù)骨缺損,在兩端骨髓腔封閉的情況下它能否為滅活移植骨提供必需的細胞、血供及生長因子修復(fù)骨缺損尚不清楚,同時誘導(dǎo)膜中生長因子含量隨時間的變化情況亦不明確,這對二期植骨時間的選擇具有重要指導(dǎo)意義,誘導(dǎo)膜與骨膜促成骨活性的異同還有待研究。本研究通過在動物體內(nèi)建立骨缺損-誘導(dǎo)膜模型,在封閉的誘導(dǎo)膜內(nèi)植入滅活自體移植骨材料以期修復(fù)骨缺損,進而在不同時間點取出誘導(dǎo)膜、骨膜組織,觀察誘導(dǎo)膜的結(jié)構(gòu)、生長因子含量隨時間的變化情況,同時將不同時間點的誘導(dǎo)膜及骨膜蛋白提取液在體外與間充質(zhì)干細胞進行培養(yǎng),觀察干細胞增值、分化情況,從而與骨膜進行比較,初步探討誘導(dǎo)膜促進滅活自體骨成骨的機制。二、研究目的1、構(gòu)建兔骨缺損誘導(dǎo)膜模型,膜內(nèi)植入滅活骨觀察誘導(dǎo)膜能否促進滅活移植骨修復(fù)骨缺損;2、通過組織切片染色及elisa蛋白定量分析誘導(dǎo)膜主要生長因子隨時間的變化情況,以尋找最佳植骨時間;3、提取誘導(dǎo)膜和骨膜的蛋白液與間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)比較它們的促成骨能力。三、材料和方法1.第三軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供新西蘭大白兔24只,雌雄不限,體重(2.35±0.12)kg,實驗兔一期在雙側(cè)橈骨中段制造1.5cm骨缺損,隨后填塞聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)骨水泥誘導(dǎo)生物膜形成,6周取出骨水泥進行二期處理,按隨機數(shù)字表法將實驗兔隨機分為實驗組、模型組和對照組,并根據(jù)分組進行不同的處理,每組8只。實驗組保留誘導(dǎo)膜并在誘導(dǎo)膜內(nèi)植入經(jīng)高溫水浴滅活(100℃30min)的自體松質(zhì)骨,模型組保留誘導(dǎo)膜不植骨,對照組小心去除誘導(dǎo)膜后植入自體滅活骨(100℃30min)。常規(guī)條件飼養(yǎng)8、12周后通過放射學(xué)檢測和組織學(xué)檢測評估新生骨形成情況。2.健康成年新西蘭大白兔32只,在動物手術(shù)室無菌條件下將新西蘭大白兔雙側(cè)橈骨制造1.5cm骨缺損,同期植入聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)骨水泥2g,縫合手術(shù)切口,常規(guī)條件下飼養(yǎng)。2、4、6、8周后取出骨水泥,仔細分離周圍包裹的誘導(dǎo)膜,同時分離正常骨膜(peristeum)以及肌外膜(epimysium)進行比較,不同時間點誘導(dǎo)膜組織、骨膜、肌外膜具體檢測項目如下:①將三種膜組織用甲醛固定后行he染色,觀察誘導(dǎo)膜組織結(jié)構(gòu)隨時間變化情況并與骨膜作比較。②提取膜蛋白組織進行elisa檢測血管內(nèi)皮生長因子vascularendothelialgrowthfactor(vegf),血管緊張素-2angiotensinii(angii),骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2bonemorphogeneticprotein2(bmp2),成纖維生長因子-2fibroblastgrowthfactor2(fgf2),前列腺素e2prostaglandine2(pge2)含量及其隨時間的變化情況,③提取膜組織蛋白液與間充質(zhì)干細胞培養(yǎng),檢測干細胞增殖和分化,同時嘗試分離鑒定誘導(dǎo)膜中貼壁生長細胞。四、結(jié)果1.實驗兔骨缺損重建模型放射學(xué)檢測可見二期處理后第8周、12周實驗組中新生骨形成明顯優(yōu)于對照組和模型組(P0.01),模型組可見少許骨痂形成,對照組未見新生骨形成;第8、12周組織學(xué)切片中觀察實驗組可見軟骨細胞形成和骨細胞,成骨明顯優(yōu)于模型組和對照組(P0.01),對照組僅可觀察到纖維連接,未見骨性連接和骨細胞。2.組織切片HE染色結(jié)果顯示誘導(dǎo)膜和骨膜均含有分界明顯的兩層,內(nèi)層含豐富的血管組織,外層為成纖維和膠原層,2周誘導(dǎo)膜組織水腫明顯,中性粒細胞多,炎癥反應(yīng)最明顯,血管最豐富,4周后誘導(dǎo)膜的厚度以及血管含量隨時間逐漸減小并趨于成熟,同時在誘導(dǎo)膜切片HE染色中觀察到軟骨內(nèi)骨化。3.三種膜蛋白提取液ELISA檢測結(jié)果顯示肌外膜中每個時間點各種蛋白含量均較低,誘導(dǎo)膜中的BMP-2、VEGF含量第6周達到高峰,在第6周誘導(dǎo)膜BMP-2的含量高于骨膜(P0.05),其余時間點跟骨膜接近。6周誘導(dǎo)膜中VEGF含量接近骨膜,其余時間點均低于骨膜。誘導(dǎo)膜中FGF2、ANG-II在第4周達到高峰后開始下降,骨膜中FGF-2一直處于較高水平,在4周和誘導(dǎo)膜含量接近,誘導(dǎo)膜中ANG-II一直高于骨膜和肌外膜,肌外膜和骨膜ANG-II沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。檢測發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)膜中PGE2的含量隨時間改變沒有明顯的變化,誘導(dǎo)膜與骨膜和肌外膜之間也無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)4.三種膜標本對間充質(zhì)干細胞增殖實驗結(jié)果表明間充質(zhì)干細胞在肌外膜蛋白提取液的培養(yǎng)基中一直處于較低增殖水平,第2、8周誘導(dǎo)膜促進間充質(zhì)干細胞增殖能力跟骨膜接近(P0.05),第4、6周誘導(dǎo)膜刺激細胞增殖能力大于骨膜(P0.05),間充質(zhì)干細胞成骨分化通過檢測堿性磷酸酶活性來評價。結(jié)果表明第2、8周誘導(dǎo)膜蛋白提取液促進間充質(zhì)干細胞成骨分化方面低于骨膜(P0.05),在第4、6周誘導(dǎo)膜和骨膜培養(yǎng)基中ALP活性接近,第4、6周誘導(dǎo)膜促進干細胞增殖作用最強,同時第4周誘導(dǎo)膜ALP活性高于其他時間點。骨膜和成熟誘導(dǎo)膜對間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化促進作用相當。我們分離培養(yǎng)得到CD44+貼壁細胞在誘導(dǎo)劑條件下能向成骨方向分化,五、結(jié)論1.誘導(dǎo)膜在植入骨水泥后4-6周主要成骨相關(guān)生長因子含量最高,成骨能力最強,此時是最佳的植骨時間;2.誘導(dǎo)膜生長因子含量及促成骨活性與骨膜接近;3.誘導(dǎo)膜能為移植骨提供生長因子和細胞從而促進滅活移植骨成骨。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R687.3

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本文編號：2393771