【摘要】：研究背景間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是來源于中胚層的多潛能干細胞,其具有很強的自我更新和多項分化潛能。在給予適宜的體內(nèi)或體外誘導(dǎo)環(huán)境下,其可分化為成骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞等。間充質(zhì)干細胞是骨與軟骨組織工程研究常用的種子細胞,在再生醫(yī)學(xué)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。骨髓來源的間充質(zhì)干細胞因獲取和培養(yǎng)簡單方便,是目前使用最為廣泛、研究最多的間充質(zhì)干細胞。間充質(zhì)干細胞的成骨、成軟骨定向分化是干細胞研究的熱點,目前其具體的定向分化機制仍不明了。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt、不編碼蛋白的RNA。其占到非編碼RNA的80%以上,但卻是目前研究及了解最少的一類RNA。其不具有蛋白編碼功能,但研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在生長發(fā)育與分化過程中發(fā)揮重要作用。lncRNA具有復(fù)雜的生物學(xué)功能,參與機體諸多生物學(xué)行為,并與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展和防治有密切的關(guān)系。然而關(guān)于lncRNA在人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨、成軟骨定向分化過程中的作用尚無系統(tǒng)的報道和研究。該研究對于間充質(zhì)干細胞定向分化過程中的IncRNAs進行了初步篩選,為后續(xù)的機制研究奠定了基礎(chǔ)。目的1.對人骨髓間充質(zhì)干細胞進行成骨及成軟骨誘導(dǎo)分化,為篩選與定向分化有關(guān)的lncRNA提供細胞樣本。2.利用Agilent human lncRNA+mRNA Array V4.0微陣列芯片技術(shù)分別篩選人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化組與未分化組、成軟骨分化組與未分化組之間差異表達的IncRNAs和mRNAs。3.利用生物信息學(xué)技術(shù)對差異表達的lncRNA和mRNA進行分析,篩選可能參與定向分化過程的lncRNA,預(yù)測其潛在的生物學(xué)功能。研究方法1.對人骨髓間充質(zhì)干細胞進行細胞培養(yǎng),對P3 MSCs分別進行成骨及成軟骨誘導(dǎo)分化,分別設(shè)立實驗組及對照組。在誘導(dǎo)分化后Day 14進行細胞染色及相關(guān)基因的檢測進行誘導(dǎo)分化的驗證。2.分別取3個成骨誘導(dǎo)分化、3個成軟骨誘導(dǎo)分化和3個正常培養(yǎng)未分化Day 14的細胞樣本作為芯片檢測樣品,提取細胞樣本的總RNA。經(jīng)質(zhì)控合格后,利用Agilent human lncRNA+mRNA Array V4.0微陣列芯片技術(shù)對定向分化組與對照組之間差異表達的lncRNAs和mRNAs進行篩選。3.通過Gene Ontology、Pathway分析以及構(gòu)建lncRNA和mRNA的共表達CNC網(wǎng)絡(luò)圖等生物信息學(xué)分析,進一步分析差異表達的lncRNAs,篩選可能與定向分化有關(guān)的lncRNAs,初步探討其生物學(xué)功能。4.采用qRT-PCR對芯片檢測結(jié)果進行驗證,并檢測感興趣的相關(guān)的lncRNAs在定向分化過程中的動態(tài)表達情況。研究結(jié)果1.我們對MSCs原代細胞進行培養(yǎng),在傳代培養(yǎng)至P3時分別進行成骨及成軟骨誘導(dǎo)分化。我們采用ALP、茜素紅染色及成骨相關(guān)基因ALP、Runx2及Col Ⅰ的檢測進行成骨分化的鑒定。對于成軟骨分化,阿利新藍染色、免疫組化染色(Aggrecan、Sox-9、 Col Ⅱ)以及成軟骨相關(guān)基因Aggrecan、Sox-9、Col Ⅱ的檢測均表明了其成功誘導(dǎo)。2.通過對芯片檢測結(jié)果進行初步分析整理,成骨分化組與未分化組間共有1206條lncRNAs差異表達(FC2.0或-2.0, P-value0.05),其中差異高表達的lncRNAs有687條,差異低表達的519條。另外,差異表達的mRNAs共2143條,其中上調(diào)表達的mRNA有957條,下調(diào)表達的mRNA有1186條。qRT-PCR對其表達情況進行驗證,結(jié)果與芯片結(jié)果一致。3.成軟骨分化組與未分化組間共有3638條lncRNAs差異表達(FC2.0或-2.0, P-value0.05),其中差異高表達2166條,差異低表達1472條。差異表達的mRNAs共5560條,其中上調(diào)1980條,下調(diào)3580條。qRT-PCR的驗證結(jié)果與芯片結(jié)果一致。4.通過GO、Pathway分析及CNC網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建,對相關(guān)的lncRNAs進行了分析及生物學(xué)功能的預(yù)測。分別對lncRNA-H19和uc022axw.1在成骨分化過程中以及l(fā)ncRNA-ZBED3-AS1和CTA-941F9.9在成軟骨分化過程中的動態(tài)表達情況進行了觀察,提示其可能參與MSCs的定向分化過程。結(jié)論1.本實驗研究以人骨髓間充質(zhì)干細胞為研究對象,對其進行了成骨及成軟骨誘導(dǎo)分化,并進行了細胞染色和分化相關(guān)基因的檢測進行了驗證,為芯片檢測提供了可靠的細胞樣本。2.首次系統(tǒng)報告通過微陣列芯片篩選了人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨、成軟骨分化與未分化之間間差異表達的lncRNAs和mRNAs,并通過GO、Pathway分析以及CNC網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建等生物信息學(xué)技術(shù)對差異表達的lncRNAs和mRNAs進行分析,初步探討了lncRNA的生物學(xué)作用。3. lncRNAs在MSCs成骨及成軟骨分化過程中存在差異表達,提示其可能在定向分化過程中的潛在作用。關(guān)于lncRNAs具體參與的調(diào)控機制需要后續(xù)的功能研究進一步探討。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R68

【參考文獻】

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1 Farbod Rastegar;Deana Shenaq;Eric R Wagner;Stephanie H Kim;Russell R Reid;Hue H Luu;Rex C Haydon;;Mesenchymal stem cells: Molecular characteristics and clinical applications[J];World Journal of Stem Cells;2010年04期

2 郭希民 ,王常勇 ,王永紅 ,段翠密 ,趙強 ,孫大銘;人骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)及向軟骨細胞定向分化的實驗研究[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2003年01期

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本文編號：2388537