【摘要】：研究背景及目的激素性股骨頭壞死(steroid-induced avascular necrosis of the femoral head,SANFH)發(fā)病機(jī)制至今未明,成骨分化障礙與其密切相關(guān)。研究表明,微小RNA-206(micro RNA-206,miR-206)可下調(diào)其靶蛋白縫隙連接蛋白43(connexin43,Cx43)繼而抑制成骨細(xì)胞分化,Cx43高表達(dá)可激活Wnt經(jīng)典信號(hào)通路,促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。而miR-206靶向Cx43調(diào)控成骨分化在SANFH中的作用尚未見報(bào)道。我們假設(shè)Cx43/miR-206通過下游Wnt經(jīng)典信號(hào)通路調(diào)控成骨細(xì)胞分化在SANFH中發(fā)揮重要作用。建立SANFH動(dòng)物模型,動(dòng)態(tài)檢測股骨頭內(nèi)成骨分化相關(guān)因子、miR-206、Cx43及Wnt經(jīng)典信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)變化,闡明miR-206靶向Cx43調(diào)控成骨分化在SANFH中的作用及潛在機(jī)制,為SANFH診療提供新靶點(diǎn)。方法1、健康新西蘭大白兔72只,雌雄各半,應(yīng)用數(shù)字隨機(jī)法分為模型組和對(duì)照組。模型組應(yīng)用內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS,10mg/kg)聯(lián)合甲基強(qiáng)的松龍(methylprednisolone,MPS,20mg/kg)建立激素性股骨頭壞死模型;對(duì)照組于相同時(shí)間注射等量生理鹽水。兩組動(dòng)物分別于造模后第2、4和8周行核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)檢查,蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色確定模型成功建立。2、應(yīng)用原位雜交(in situ hybridization,ISH)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測兔股骨頭內(nèi)miR-206表達(dá),RT-PCR和Westernblot檢測Cx43、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、Dickkopf相關(guān)蛋白1(dickkopf-related protein 1,Dkk1)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin),免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)檢測Cx43表達(dá)。結(jié)果1、MRI檢查顯示模型組兔雙側(cè)股骨頭T1WI信號(hào)強(qiáng)度降低,呈線樣或斑點(diǎn)狀,T2WI呈不均勻高信號(hào);對(duì)照組兔雙側(cè)股骨頭T1WI和T2WI未見異常信號(hào)。光鏡觀察顯示模型組兔股骨頭內(nèi)骨小梁變細(xì),甚至斷裂,脂肪細(xì)胞增多增大,空骨餡窩增加;對(duì)照組兔股骨頭內(nèi)骨小梁結(jié)構(gòu)完整,骨細(xì)胞清晰可見,空骨陷窩少見,脂肪細(xì)胞相對(duì)較少。模型組與對(duì)照組空骨陷窩率、脂肪細(xì)胞直徑比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),模型成功建立。2、ALP染色顯示ALP主要陽性表達(dá)于骨小梁邊緣的成骨細(xì)胞,且模型組染色強(qiáng)度較對(duì)照組弱;RT-PCR結(jié)果顯示模型組ALP和Runx2 m RNA表達(dá)量較正常組均降低(p0.05),Western blot結(jié)果表明Runx2蛋白在模型組兔股骨頭內(nèi)表達(dá)較對(duì)照組減少(p0.05)。ISH結(jié)果顯示miR-206陽性表達(dá)于髓腔、成骨細(xì)胞及少量骨細(xì)胞內(nèi),且模型組兔股骨頭內(nèi)著色較對(duì)照組強(qiáng)。RT-PCR結(jié)果表明模型組兔股骨頭內(nèi)miR-206表達(dá)較對(duì)照組增多(p0.05),且隨時(shí)間推移有上升趨勢。ICH結(jié)果顯示Cx43陽性表達(dá)于髓腔細(xì)胞及成骨細(xì)胞,且模型組兔股骨頭內(nèi)Cx43染色強(qiáng)度較對(duì)照組弱。RT-PCR和Western blot結(jié)果表明模型組兔股骨頭內(nèi)Cx43和β-catenin m RNA和蛋白均較對(duì)照組表達(dá)減少,而Dkk1蛋白和m RNA表達(dá)量較對(duì)照組明顯增多(p0.05)。結(jié)論1、應(yīng)用內(nèi)毒素聯(lián)合甲強(qiáng)龍可成功建立兔激素性股骨頭壞死模型。2、成骨分化障礙與激素性股骨頭壞死密切相關(guān)。3、miR-206可能通過下調(diào)其靶蛋白Cx43,抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo),進(jìn)而抑制成骨分化參與激素性股骨頭壞死發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。
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【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R681.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2362749