發(fā)布時(shí)間：2018-11-23 09:07

【摘要】：背景和目的伴隨經(jīng)濟(jì)水平的逐步提高,飲酒的人越來越多,酒精性股骨頭壞死(alcohol-induced osteonecrosis of the femoral head,AONFH)也成為骨科常見疾病之一,并有逐年增加的趨勢(shì)。在未經(jīng)有效治療者中約80%將發(fā)生股骨頭塌陷,關(guān)節(jié)功能受損毀壞,有極高的致殘率,嚴(yán)重威脅著人類的健康和生活,此時(shí)保守治療也已失去臨床意義,因此預(yù)防酒精性股骨頭壞死的發(fā)生突顯重要。目前,有多種關(guān)于股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)理,如微血管損傷學(xué)說、股骨頭內(nèi)脂肪栓塞學(xué)說、股骨頭內(nèi)高壓導(dǎo)致靜脈瘀滯學(xué)說、全身或局部高凝低纖溶學(xué)說以及骨質(zhì)疏松學(xué)說等等。經(jīng)過大量深入研究,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在酒精的影響下,不僅其股骨頭細(xì)胞內(nèi)成骨基因表達(dá)明顯降低,成脂基因表達(dá)明顯增高;而且其骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMCSs)成脂分化和抑制其成骨分化,引起股骨頭內(nèi)脂肪沉積,內(nèi)壓升高,血供減少,最后造成股骨頭缺血壞死。作為一種誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子,過氧化物酶體增殖子活化受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)在脂肪分化中表達(dá),但在前脂肪細(xì)胞中不表達(dá),并比大多數(shù)脂肪基因先表達(dá),前脂肪細(xì)胞在沒有PPARγ時(shí)很難分化為脂肪細(xì)胞。綜上可推測(cè),如果PPARγ基因表達(dá)被阻斷,那么MBSCs在酒精誘導(dǎo)下成脂分化過程就可以被阻止;從而早期酒精性股骨頭壞死的有效預(yù)防也成為可能。本研究擬將構(gòu)建的mi R-548d-5p片段電轉(zhuǎn)入大鼠體外BMSCs中,靶向阻止BMSCs中的PPARγ基因表達(dá),抑制BMSCs向脂肪細(xì)胞分化,從而在早期阻止酒精誘導(dǎo)BMSCs成脂分化的過程,即希望從酒精性股骨頭壞死發(fā)病機(jī)理的初始關(guān)鍵環(huán)節(jié)上預(yù)防該疾病發(fā)生。材料與方法選取2月齡雄性大鼠處死后取骨髓,制備大鼠BMSCs。實(shí)驗(yàn)分4組,空白對(duì)照組:未作特殊處理的BMSCs;模型組:0.09mol/L酒精+BMSCs;無關(guān)序列組:0.09mol/L酒精+電轉(zhuǎn)入無關(guān)序列的BMSCs;基因組:0.09mol/L酒精+電轉(zhuǎn)入mi R-548d-5p的BMSCs。將制備的第2代BMSCs按分組條件處理后接種于6孔培養(yǎng)板中,并且按實(shí)驗(yàn)要求加入酒精,始終保持培養(yǎng)液中酒精濃度為0.09mol/L;而且,每次BMSCs換液時(shí)也要重新加入酒精,濃度仍為0.09mol/L。每天在倒置顯微鏡下觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)及生長狀況,并做好實(shí)驗(yàn)記錄。在BMSCs被酒精誘導(dǎo)第3和7天,采用TaqMan RT-PCR方法和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry,ICC)分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中各組BMSCs內(nèi)PPARγm RNA、BMP-2 m RNA和Runx2 m RNA,以及相應(yīng)蛋白表達(dá)量的變化。在BMSCs被酒精誘導(dǎo)第14天,用相應(yīng)ELISA試劑盒檢測(cè)BMSCs中甘油三酯(Triglyceride,TG)含量和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性;在BMSCs被酒精誘導(dǎo)第14天,將培養(yǎng)的BMSCs用油紅O進(jìn)行染色,并且計(jì)數(shù)脂肪細(xì)胞,最后做好實(shí)驗(yàn)記錄。結(jié)果1 BMSCs中PPARγm RNA、BMP-2 m RNA及Runx2 m RNA及相應(yīng)蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果酒精誘導(dǎo)第3和7天,模型組和無關(guān)序列組PPARγmRNA呈高表達(dá),與空白對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)�；蚪MPPARγm RNA呈低表達(dá),與模型組和無關(guān)序列組之間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。酒精誘導(dǎo)第3和7天,模型組和無關(guān)序列組BMP-2 m RNA及Runx2 m RNA均呈低表達(dá),與空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而與空白對(duì)照組比較,基因組BMP-2m RNA及Runx2 m RNA的表達(dá)水平接近,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示:與模型組和無關(guān)序列組相比較,基因組和空白對(duì)照組中相關(guān)基因的蛋白表達(dá)明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2 BMSCs的成骨分化堿性磷酸酶活性及成脂分化甘油三酯含量檢測(cè)結(jié)果酒精誘導(dǎo)第14天檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性及甘油三酯含量,與空白對(duì)照組比較,模型組和無關(guān)序列組中堿性磷酸酶活性均降低、甘油三酯含量增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與空白對(duì)照組比較,基因組中堿性磷酸酶活性稍降低、甘油三酯含量接近,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2 BMSCs成脂分化油紅O染色和脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果酒精誘導(dǎo)第14天油紅O染色后脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果表明,與空白對(duì)照組比較,模型組和無關(guān)序列組脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)均升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與模型組和無關(guān)序列組兩組相比較,基因組脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);但是和空白對(duì)照組相近,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.體外大鼠BMSCs實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證明:mi R-548d-5p可以有效阻斷酒精誘導(dǎo)BMSCs內(nèi)PPARγm RNA的表達(dá),抑制其成脂分化并維持成骨分化。2.利用mi R-548d-5p阻斷BMSCs內(nèi)PPARγ基因表達(dá)的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),有望為預(yù)防或治療酒精性O(shè)NFH的發(fā)生提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R681.8

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 帥波;非創(chuàng)傷性O(shè)NFH患者脂質(zhì)代謝相關(guān)因子及血小板活化相關(guān)因子的臨床研究及中醫(yī)藥的治療作用[D];華中科技大學(xué);2011年

2 曹亞偉;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和傘狀支撐骨移植術(shù)治療股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究[D];鄭州大學(xué);2010年

3 劉鳴;siRNA阻斷PPARγ基因表達(dá)預(yù)防激素性股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究[D];鄭州大學(xué);2012年

4 張永興;股骨頭局灶性骨壞死動(dòng)物模型的研制及應(yīng)用[D];軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2001年

5 郭坤亮;內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素在酒精性股骨頭缺血壞死發(fā)病機(jī)制中的作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2003年

6 劉慧松;酒精性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)理及相關(guān)研究[D];蘇州大學(xué);2003年

7 王兆杰;股骨頭缺血壞死的發(fā)病機(jī)制及與血栓前狀態(tài)關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究[D];四川大學(xué);2005年

8 彭吾訓(xùn);組織工程骨修復(fù)兔股骨頭壞死模型的實(shí)驗(yàn)研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2006年

9 劉武;補(bǔ)腎法對(duì)酒精干預(yù)成骨樣細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)及相關(guān)臨床研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2007年

10 陳鎮(zhèn)秋;酒精性股骨頭壞死保髖療效的相關(guān)性研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2009年

，

本文編號(hào)：2351013