【摘要】：背景創(chuàng)傷性脊髓損傷可以導(dǎo)致不同程度的感覺和運動功能障礙,嚴重者可導(dǎo)致癱瘓,為家庭及社會帶來巨大負擔。嚴重的創(chuàng)傷性脊髓損傷目前并無高效的治療方法。根據(jù)致傷因素不同和時間發(fā)生順序的先后,創(chuàng)傷性脊髓損傷可分為兩個時相,即原發(fā)性損傷期和繼發(fā)性損傷期,在這兩個時期造成的脊髓損傷分別稱為脊髓原發(fā)性損傷(主要包括擠壓傷、創(chuàng)傷、橫斷傷等機械性損傷)和脊髓繼發(fā)性損傷。在創(chuàng)傷性脊髓損傷的繼發(fā)性損傷期,多種生物活性物質(zhì)釋放,如活性氧簇物質(zhì)(ROS)的釋放,羥基、氧自由基、超氧化合物、脂質(zhì)過氧化物、氮氧化合物可以產(chǎn)生氧化應(yīng)激作用,干擾細胞正常代謝,增強炎癥細胞的浸潤,引起炎癥反應(yīng)的加重,甚至最終導(dǎo)致神經(jīng)元細胞以及神經(jīng)膠質(zhì)細胞壞死和凋亡,造成不可逆的中樞神經(jīng)組織損傷。此外,在創(chuàng)傷性脊髓損傷的繼發(fā)性損傷時期,炎癥反應(yīng)對于脊髓繼發(fā)性損傷起到了至關(guān)重要的作用。在這一時期,脊髓組織內(nèi)的巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞以及少突膠質(zhì)細胞被活化,釋放大量炎癥因子和趨化因子,諸如IL-1β、TNF-α、IL-6等,可引起一系列復(fù)雜的炎癥級聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致脊髓出現(xiàn)脫髓鞘、灰質(zhì)溶解、結(jié)締組織沉積以及反應(yīng)性膠質(zhì)化形成膠質(zhì)瘢痕等,造成神經(jīng)功能嚴重損傷并阻礙神經(jīng)細胞再生修復(fù)。氫氣作為治療性醫(yī)用氣體最早見于Dole在1975年的報道,證實其可有效抑制白化裸鼠鱗狀上皮細胞癌的發(fā)展。之后,對氫氣在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究逐漸深入,并發(fā)現(xiàn)分子氫對心臟、肝臟、腎、肺、腦、胰腺、小腸、結(jié)腸、脊髓、視網(wǎng)膜、聽毛細胞等多種器官及組織具有損傷保護作用,并對2型糖尿病等代謝性疾病有緩解治療作用,此外,對于速發(fā)型超敏反應(yīng)也有一定的抑制作用。多項研究已經(jīng)證明,分子氫安全無生物毒副作用,制備簡便,可通過多種途徑給藥,有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),分子氫通過直接吸入、氫飽和生理鹽水靜脈注射、氫飽和生理鹽水腹腔注射、氫飽和純凈水飲用、氫飽和生理鹽水滴眼,都可達到較好效果的抗損傷治療效果。氫分子進入體內(nèi)后可通過彌散作用自由透過細胞膜和細胞器膜,發(fā)揮抗氧化、抗凋亡、抗炎癥反應(yīng)以及抗超敏反應(yīng)的作用,最終形成達到保護組織器官損傷的治療效果。Ohsawa等研究者于2007年首次將氫氣應(yīng)用于改善神經(jīng)系統(tǒng)損傷,證實了氫分子對腦部缺血-再灌注損傷具有良好的抗氧化保護作用,從而開啟了氫在神經(jīng)系統(tǒng)疾病領(lǐng)域的研究。氫在脊髓損傷中的研究目前多集中于脊髓缺血再灌注損傷,對于在急性創(chuàng)傷性脊髓損傷中氫分子的抗炎癥反應(yīng)作用研究甚少。目的本實驗將氫飽和生理鹽水通過腹腔注射作用于創(chuàng)傷性脊髓損傷SD大鼠模型,目的在于研究氫飽和生理鹽水在創(chuàng)傷性脊髓損傷中對脊髓損傷區(qū)域小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞激活、趨化聚集的影響,以及對炎癥因子IL-1β、TNF-α釋放的抑制作用,并進一步研究氫飽和生理鹽水對創(chuàng)傷性脊髓損傷繼發(fā)損傷期損傷區(qū)域嘌呤能受體P2X7R在小膠質(zhì)細胞中活化表達的影響以及P2Y2R在星形膠質(zhì)細胞中活化表達的影響,探討P2X7R與P2Y2R的特異性配體三磷酸腺苷(ATP)在炎癥反應(yīng)中的重要作用,考察分子氫在脊髓損傷后的抗炎癥反應(yīng)效應(yīng),以期為臨床脊髓損傷提供一種新的抗炎癥反應(yīng)治療方法。方法1.SD大鼠創(chuàng)傷性脊髓損傷模型的建立:取雄性Sprague-Daley大鼠72只,體重250-300g,隨機等分三組:假手術(shù)+生理鹽水注射組(Sham),手術(shù)+生理鹽水注射組(Control),手術(shù)+氫飽和生理鹽水注射組(HS)。三組大鼠均行胸椎(T7-T8)椎板切除術(shù),手術(shù)組根據(jù)Gruner介紹的自由落體脊髓打擊方法建立大鼠脊髓急性創(chuàng)傷模型,假手術(shù)組只進行椎板切開,不進行脊髓打擊處理。24只大鼠于脊髓損傷后4小時處死,其余所有大鼠均于脊髓損傷后96小時處死。2.氫飽和生理鹽水的制備:根據(jù)Ohsawa介紹的方法,將氫氣在0.4MPa的條件下溶解于生理鹽水6小時,即可成功制備氫飽和生理鹽水,保持氫在生理鹽水中的濃度不低于0.6nmol/L,并保存于加壓密封鋁包中備用。3.氫飽和生理鹽水干預(yù):在SD大鼠脊髓損傷后0小時、24小時、48小時、72小時分別進行普通生理鹽水和氫飽和生理鹽水腹腔注射,注射計量為10 ml/kg體重。假手術(shù)+生理鹽水注射組(Sham)注射普通生理鹽水;手術(shù)+生理鹽水注射組(Control)注射普通生理鹽水;手術(shù)+氫飽和生理鹽水注射組(HS)注射氫飽和生理鹽水。4.SD大鼠脊髓損傷96小時后,采集大鼠血清及腦脊液樣本,通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定其外周血和腦脊液中炎癥因子TNF-α和IL-1β的含量水平。5.SD大鼠脊髓損傷96小時后,以打擊點為中心采集脊髓組織樣本,PFA固定后冰凍切片,通過免疫熒光技術(shù)測定受損區(qū)域小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞活化和趨化聚集水平,同時進行嘌呤能受體P2X7R與小膠質(zhì)細胞共標免疫熒光染色,評估P2X7R在小膠質(zhì)細胞上的表達變化以及嘌呤能受體P2Y2R與星形膠質(zhì)細胞共標免疫熒光染色,評估P2Y2R在星形膠質(zhì)細胞上的表達變化。6.SD大鼠脊髓損傷96小時后,以打擊點為中心采集脊髓組織樣本,通過WesternBlotting技術(shù)測定損傷區(qū)域嘌呤能受體P2X7R與P2Y2R的蛋白表達水平。7.分別在SD大鼠脊髓損傷4小時和96小時后,采集腦脊液,用細胞外ATP濃度檢測試劑盒進行腦脊液ATP含量測定。8.SD大鼠脊髓損傷96小時后,以打擊點為中心采集脊髓組織樣本,PFA固定后石蠟包埋切片,分別進行HE染色以及TUNEL、caspase-3免疫組織化學(xué)染色,從組織形態(tài)學(xué)評估脊髓損傷程度、炎癥細胞浸潤程度以及脊髓細胞凋亡程度。9.BBB運動功能評分:在SD大鼠脊髓損傷模型建立前以及建立之后24小時、48小時、72小時、96小時分別進行BBB運動功能評分(Basso Beattie Bresnahan scale),并由不同觀察者獨立記錄大鼠后肢運動功能變化情況。10.統(tǒng)計學(xué)處理方法:用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。記錄數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差((?)±S)。組間兩兩比較使用SNK-q檢驗。P0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果1.成功建立SD大鼠創(chuàng)傷性脊髓損傷模型。成功制備氫飽和生理鹽水。2.SD大鼠脊髓損傷96小時后,手術(shù)+氫飽和生理鹽水腹腔注射組(HS)的外周血和腦脊液中TNF-α和IL-1β水平較手術(shù)+生理鹽水注射對照組(Control)均出現(xiàn)明顯下降。其中,外周血TNF-α水平從653.58±50.27pg/ml降至401.91±23.84pg/ml;腦脊液TNF-α水平從203.53±58.85pg/ml降至84.87±19.20pg/ml。外周血IL-1β水平從476.88±37.80pg/ml降至277.19±33.73pg/ml;腦脊液IL-1β水平從83.05±6.53pg/ml降至46.68±5.14pg/ml。3.免疫熒光染色顯示,大鼠脊髓損傷96小時后,手術(shù)+生理鹽水注射對照組(Control)脊髓損傷區(qū)域的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞被激活,發(fā)生趨化聚集。手術(shù)+氫飽和生理鹽水腹腔注射(HS)干預(yù)可明顯減輕脊髓小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的活化和集聚。嘌呤能受體P2X7R在小膠質(zhì)細胞的表達與小膠質(zhì)細胞活化程度表現(xiàn)一致,P2Y2R在星形膠質(zhì)細胞的表達與星形膠質(zhì)細胞活化程度表現(xiàn)一致,氫飽和生理鹽水干預(yù)同樣可以抑制P2X7R和P2Y2R的表達。4.SD大鼠脊髓損傷96小時后,對損傷脊髓打擊區(qū)域組織進行Western Blotting檢測顯示,手術(shù)+生理鹽水注射對照組(Control)大鼠脊髓損傷區(qū)域嘌呤能受體P2X7R和P2Y2R蛋白表達水平升高,手術(shù)+氫飽和生理鹽水腹腔注射(HS)干預(yù)可顯著降低P2X7R以及P2Y2R蛋白含量水平。5.SD大鼠脊髓損傷4小時后,進行腦脊液ATP含量測定,手術(shù)+生理鹽水注射對照組(Control)大鼠腦脊液中ATP含量迅速上升至600.40±149.90nmol/L,手術(shù)+氫飽和生理鹽水腹腔注射(HS)干預(yù)可使ATP含量下降至144.51±25.13nmol/L。髓損損傷96小時后,相對于手術(shù)+生理鹽水注射對照組(Control),手術(shù)+氫飽和生理鹽水腹腔注射(HS)干預(yù)可使腦脊液中ATP含量從220.70±35.49 nmol/L降至118.21±16.29 nmol/L。6.HE染色顯示,大鼠脊髓損傷96小時后,手術(shù)+生理鹽水注射對照組(Control)大鼠損傷區(qū)域脊髓組織出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤和組織液化,手術(shù)+氫飽和生理鹽水腹腔注射(HS)干預(yù)可減輕炎癥細胞浸潤和脊髓組織液化程度。細胞凋亡相關(guān)TUNEL、caspase-3免疫組織化學(xué)染色顯示,大鼠脊髓損傷96小時后,手術(shù)+生理鹽水注射對照組(Control)大鼠脊髓損傷區(qū)域出現(xiàn)大量凋亡細胞,手術(shù)+氫飽和生理鹽水腹腔注射(HS)干預(yù)可明顯減少凋亡細胞數(shù)量。7.大鼠脊髓損傷96小時后,手術(shù)+氫飽和生理鹽水腹腔注射組(HS)大鼠的的后肢運動功能BBB評分在脊髓損傷后24小時、48小時、72小時、96小時明顯高于手術(shù)+生理鹽水干預(yù)對照組(Control),提示大鼠脊髓損傷后氫飽和生理鹽水干預(yù)可使大鼠后肢運動功能更好恢復(fù)。結(jié)論1.創(chuàng)傷性脊髓損傷可導(dǎo)致SD大鼠運動功能減退,并在脊髓損傷局部可出現(xiàn)炎癥細胞浸潤和組織液化,小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞激活并大量聚集,炎癥因子TNF-α、IL-1β含量水平上升,說明創(chuàng)傷性脊髓損傷在損傷繼發(fā)期出現(xiàn)了明確的炎癥反應(yīng)。2.與炎癥因子IL-1β和TNF-α釋放與小膠質(zhì)細胞活化密切相關(guān)的重要嘌呤能受體P2X7R在小膠質(zhì)細胞中的表達與小膠質(zhì)細胞活化水平一致,同時與IL-1β和TNF-α含量水平變化相一致,說明P2X7R在創(chuàng)傷性脊髓損傷繼發(fā)期炎癥反應(yīng)中具有重要作用。3.嘌呤能受體P2Y2R在星形膠質(zhì)細胞中的表達與星形膠質(zhì)細胞活化水平相一致,說明P2Y2R與脊髓星形膠質(zhì)細胞活化、增生密切相關(guān),在創(chuàng)傷性脊髓損傷繼發(fā)期膠質(zhì)瘢痕形成中具有重要作用。4.ATP作為嘌呤能受體P2X7R和P2Y2R的特異性配體,其在腦脊液中的含量水平在創(chuàng)傷性脊髓損傷初期(4小時)即可出現(xiàn)顯著上升,這一現(xiàn)象與脊髓組織遭受機械性打擊損傷造成的細胞破裂ATP釋放有關(guān)。在SD大鼠脊髓損傷96小時后,腦脊液中ATP含量水平仍保持較高水平,這與ATP刺激星形膠質(zhì)細胞和凋亡細胞上的另一嘌呤能受體P2Y2R使ATP不斷持續(xù)釋放有關(guān)。5.腦脊液中ATP含量水平變化與P2X7R表達水平變化以及小膠質(zhì)細胞活化水平和IL-1β和TNF-α釋放水平均呈現(xiàn)一致變化趨勢,提示ATP引起的P2X7R活化進而介導(dǎo)炎癥因子的釋放是脊髓損傷繼發(fā)期炎癥反應(yīng)的一個路徑。另外,ATP含量水平變化與P2Y2R表達水平以及星形膠質(zhì)細胞的活化增殖水平均呈現(xiàn)一致變化趨勢,提示ATP引起的P2Y2R活化是介導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞在脊髓炎癥反應(yīng)繼發(fā)期激活并形成膠質(zhì)瘢痕的一個路徑。6.氫飽和生理鹽水干預(yù)可以明顯抑制創(chuàng)傷性脊髓損傷后腦脊液中ATP的釋放,降低嘌呤能受體P2X7R和P2Y2R的表達,并抑制脊髓損傷繼發(fā)期小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的活化聚集,減輕細胞凋亡,有效降低炎癥因子IL-1β和TNF-α水平,促進脊髓損傷后的運動功能改善。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R651.2

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本文編號：2349531