【摘要】：研究背景肝再生現(xiàn)象見(jiàn)于肝切除、門(mén)靜脈分支栓塞和活體肝移植等情況。肝臟生理功能復(fù)雜,再生能力強(qiáng),外科手術(shù)預(yù)后與肝再生能力密切相關(guān),探索肝再生機(jī)制對(duì)預(yù)防術(shù)后發(fā)生肝衰和改善預(yù)后十分重要。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),門(mén)靜脈高壓灌注對(duì)于促進(jìn)肝再生和維護(hù)肝功能十分重要。門(mén)靜脈血流變化似乎是啟動(dòng)和維持肝再生過(guò)程、甚至是終止肝再生過(guò)程的必要因素。部分肝切除術(shù)后,單位組織剩余肝臟得到了更多的血流供應(yīng),因?yàn)樗枰菁{術(shù)前分配給已切除肝葉的門(mén)靜脈血流。在狗部分肝切除術(shù)同時(shí)實(shí)施門(mén)腔分流術(shù)的實(shí)驗(yàn)中,肝再生能力明顯下降。近年來(lái),在臨床活體肝移植和部分肝切除術(shù)的研究中也發(fā)現(xiàn),術(shù)后即刻增加的“門(mén)靜脈血流／肝臟體積比”和門(mén)靜脈壓力增加刺激并調(diào)控著肝臟的再生；為預(yù)防小肝綜合征的發(fā)生,如果實(shí)施“矯枉過(guò)正”的門(mén)腔分流,血流灌注量和壓力明顯下降則導(dǎo)致肝萎縮的發(fā)生。人們觀察到另外一個(gè)現(xiàn)象,肝細(xì)胞增殖先后由門(mén)靜脈周圍逐步發(fā)生至肝小葉周圍區(qū)域,中央靜脈周圍的肝細(xì)胞最晚發(fā)生增殖；由門(mén)靜脈至肝靜脈的壓力梯度中,門(mén)靜脈周圍肝細(xì)胞所受應(yīng)力大于中央靜脈周圍肝細(xì)胞,此現(xiàn)象進(jìn)一步推測(cè)：受應(yīng)力大的肝細(xì)胞增殖反應(yīng)可能先于受應(yīng)力小的肝細(xì)胞。但血流動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)肝再生的具體機(jī)制目前仍然未知,可能與門(mén)靜脈壓力引起的相關(guān)力學(xué)信號(hào)通路的激活相關(guān)。力學(xué)作用下,ECM中的配體與細(xì)胞膜整合素受體結(jié)合,“ECM-整合素-CSK”信號(hào)途徑最先被激活,力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)并通過(guò)下游信號(hào)分子調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖。而FAK是該力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要組成部分。整合素與ECM相應(yīng)配體結(jié)合后聚集成簇分布,引起FAK的Tyr殘基磷酸化,激活FAK,進(jìn)一步催化胞質(zhì)中其下游若干信息分子磷酸化,并通過(guò)"crosstalk"與生長(zhǎng)因子受體通路相聯(lián)而將細(xì)胞信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)。在力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中,FAK被認(rèn)為是力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的“啟動(dòng)子”。然而,在肝再生過(guò)程中,血流力學(xué)信號(hào)刺激是否引起FAK的表達(dá)與活性變化,從而調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的增殖尚未見(jiàn)到文獻(xiàn)報(bào)道。此外,我們已經(jīng)熟知肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte growth factor, HGF)是促進(jìn)肝細(xì)胞增殖最重要的完全絲裂原物質(zhì)。HGF與c-Met蛋白結(jié)合后,激活受體PTK,使受體自身磷酸化,并使胞漿信使蛋白質(zhì)磷酸化,同時(shí)啟動(dòng)幾條信號(hào)通路,將增殖信號(hào)傳至細(xì)胞內(nèi),通過(guò)調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)而促進(jìn)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)。HGF/c-Met啟動(dòng)的Ras/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被認(rèn)為是肝細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖最重要的信號(hào)通路。遺傳性尿激酶缺失大鼠或c-Met缺失大鼠肝再生能力非常差；采用RNA干擾技術(shù)“關(guān)閉”c-Met,肝細(xì)胞增殖周期出現(xiàn)停滯。然而,有學(xué)者發(fā)現(xiàn),流體切應(yīng)力引起肝細(xì)胞增殖可能也與這一化學(xué)通道相關(guān)：流體切應(yīng)力改變了肝細(xì)胞周圍的微環(huán)境,并將胞外物理／化學(xué)信號(hào)(HGF...c-Met)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi),經(jīng)過(guò)系列級(jí)聯(lián)放大反應(yīng),表現(xiàn)出增殖等各種效應(yīng)。Webber等人研究發(fā)現(xiàn),向正常大鼠的門(mén)靜脈中注入HGF,肝細(xì)胞增殖不明顯,而向行30%肝切除術(shù)的大鼠門(mén)靜脈中注入HGF,肝細(xì)胞明顯增殖。由此推測(cè),HGF介導(dǎo)的化學(xué)信號(hào)途徑和流體切應(yīng)力介導(dǎo)的力學(xué)信號(hào)途徑可能對(duì)肝細(xì)胞的增殖有協(xié)同刺激作用,然而,該假設(shè)尚未見(jiàn)到文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)上述假說(shuō)展開(kāi)研究。研究目的本實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分,分別探討在體、離體生物力學(xué)(流體力學(xué))對(duì)肝再生的影響,以及HGF是否在該過(guò)程中有協(xié)同作用。(一)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：以SD大鼠為研究對(duì)象；制作不同比例肝葉切除模型;于術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量門(mén)靜脈壓力(PVP)值,同時(shí)獲取肝組織；免疫組化的方法檢測(cè)肝組織FAK和肝細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)的表達(dá)；探討門(mén)靜脈壓力變化在大鼠肝再生中的作用以及力學(xué)信號(hào)因子FAK表達(dá)的情況。(二)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：以永生化大鼠BRL-3A肝細(xì)胞株和人HepG2肝癌細(xì)胞株為研究對(duì)象；制作流體應(yīng)力加載細(xì)胞培養(yǎng)裝置；在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加載不同力值的流體切應(yīng)力；觀察細(xì)胞增殖情況并探討該過(guò)程中HGF存在與否的情況下細(xì)胞增殖的差異。研究方法(一)PVP對(duì)肝再生促進(jìn)作用及其過(guò)程中力學(xué)信號(hào)關(guān)鍵蛋白FAK表達(dá)的研究：1.選取清潔級(jí)健康Sprague Dawley(SD)大鼠64只為研究對(duì)象；2.建立不同比例(30%、50%、70%)肝切除術(shù)模型；3. 實(shí)驗(yàn)分組：將大鼠平均分為對(duì)照組、30%、50%、70%比例肝葉切除術(shù)四組；4. 指標(biāo)測(cè)定和標(biāo)本獲取：分別于術(shù)后24 h、48 h、72 h、168 h進(jìn)行各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物PVP測(cè)定,同時(shí)獲取肝組織標(biāo)本；5. 免疫組化方法檢測(cè)各組肝組織細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)與FAK的表達(dá)；6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用t檢驗(yàn)和pearson相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)的方法,探索PVP、PCNA、FAK以及肝組織再生之間的關(guān)系。(二)流體切應(yīng)力與HGF協(xié)同作用促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的研究：1.研究對(duì)象：永生化大鼠BRL-3A肝細(xì)胞株和人HepG2肝癌細(xì)胞株；2.構(gòu)建流體切應(yīng)力加載細(xì)胞培養(yǎng)裝置：3.實(shí)驗(yàn)分組：1)對(duì)照組：放入本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的培養(yǎng)加力裝置但不加切應(yīng)力；2)A組(BRL-3A單純加壓組)：對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞施加不同大小的流體切應(yīng)力(0,12 dyn/cm2,24 dyn/cm2);3)B組(BRL-3A添加HGF的加壓組)：在添加HGF的情況下對(duì)細(xì)胞施加上述不同大小的力；4)C組(HepG2單純加壓組)：對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞施加不同大小的流體切應(yīng)力(0,12 dyn/cm2,24 dyn/cm2);5)D組(HepG2添加HGF的加壓組)：在添加HGF的情況下對(duì)細(xì)胞施加上述不同大小的力。4.采用直接細(xì)胞計(jì)數(shù)和CCK-8 (Cell Counting Kit-8)技術(shù)檢測(cè)不同組別的細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)情況,觀察流體切應(yīng)力是否促進(jìn)永生化大鼠BRL-3A肝細(xì)胞株和人HepG2肝癌細(xì)胞株的增殖以及HGF在該過(guò)程中是否有協(xié)同作用。5.對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(一)PVP對(duì)大鼠肝再生促進(jìn)作用及其過(guò)程中力學(xué)信號(hào)關(guān)鍵蛋白FAK的表達(dá)：1.門(mén)靜脈壓力：與對(duì)照組比較,各肝葉切除組術(shù)后各組門(mén)靜脈壓力均有升高：50%與70%組,術(shù)后24 h達(dá)到高峰(P0.01),隨后逐漸下降,并在168 h與對(duì)照組水平接近(P0.05);30%切除組24 h門(mén)靜脈壓力略有升高(P0.05),隨后下降至與對(duì)照組水平接近(P0.05)。2.免疫組化檢測(cè)PCNA:免疫陽(yáng)性染色呈棕黃色,分布于細(xì)胞核內(nèi),細(xì)胞質(zhì)略有著色。對(duì)照組大鼠肝組織內(nèi)可見(jiàn)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少,染色淺淡。按時(shí)序觀察,各肝葉切除組肝組織術(shù)后24h均可見(jiàn)PCNA表達(dá)顯著增強(qiáng)(數(shù)量增多、染色深)(P0.01)；隨后逐漸降低。術(shù)后168 h 70%切除組PCNA表達(dá)仍高于對(duì)照組(P0.05),其余兩組接近對(duì)照組或略高于對(duì)照組(P0.05)。按肝葉切除比例觀察,在相同時(shí)間點(diǎn),肝切除比例越高,PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量越多,染色越深。3.免疫組化檢測(cè)FAK:FAK主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),對(duì)照組中可見(jiàn)胞質(zhì)淡黃色以及少量棕黃色表達(dá),各肝葉切除組術(shù)后24 h均可見(jiàn)FAK表達(dá)增強(qiáng)(陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)和染色深度增加)(P0.01)；50%和70%切除組術(shù)后24 h和72 h陽(yáng)性細(xì)胞逐漸降低,但仍高于對(duì)照組(P0.05,P0.01),術(shù)后168 h陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸下降,接近對(duì)照組水平(P0.05)。30%切除組術(shù)后24 h和72h陽(yáng)性細(xì)胞接近或略高于對(duì)照組(P0.05)。相同時(shí)間點(diǎn),肝切除比例越高,FAK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量越多,染色越深。4.相關(guān)性分析1)PVP與PCNA相關(guān)性：a.70%肝切除組：大鼠PVP在術(shù)后24 h、48 h、72 h、168 h和肝再生時(shí)間正相關(guān)(P0.05)。b.50%肝切除組：大鼠PVP在術(shù)后24 h、48 h、72 h和肝再生時(shí)間正相關(guān)(P0.05),術(shù)后168 h,PVP與肝再生時(shí)間無(wú)相關(guān)性(P0.05)。c.30%肝切除組：大鼠PVP在術(shù)后24 h、72 h和肝再生時(shí)間正相關(guān),(P0.05),術(shù)后48 h、168 hPVP與肝再生時(shí)間無(wú)相關(guān)性(P0.05)。2) PVP與FAK的相關(guān)性：a.70%肝切除組：大鼠PVP在術(shù)后24 h、48 h、72 h和剩余肝細(xì)胞FAK的表達(dá)呈正相關(guān)(P0.05),在術(shù)后168 h兩者表達(dá)無(wú)相關(guān)性(P0.05)。b.50%肝切除組：大鼠PVP在術(shù)后24 h、48 h、72 h和剩余肝細(xì)胞FAK的表達(dá)呈正相關(guān)(P0.05),在術(shù)后168 h兩者表達(dá)無(wú)相關(guān)性(P0.05)。c.30%肝切除組：大鼠PVP在術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均無(wú)相關(guān)性(P0.05)。3) PCNA與FAK的相關(guān)性：a.70%肝切除組：大鼠PCNA在術(shù)后24 h、48 h、72 h和剩余肝細(xì)胞FAK的表達(dá)呈正相關(guān)(P0.05),在術(shù)后168 h兩者表達(dá)無(wú)相關(guān)性(P0.05)。b.50%肝切除組：大鼠PCNA在術(shù)后24 h、48 h、72 h和剩余肝細(xì)胞FAK的表達(dá)呈正相關(guān)(P0.05),在術(shù)后168 h兩者表達(dá)無(wú)相關(guān)性(P0.05)。c.30%肝切除組：大鼠PCNA在術(shù)后48 h和剩余肝細(xì)胞FAK的表達(dá)呈正相關(guān),其余各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均無(wú)相關(guān)性(P0.05)。(二)流體切應(yīng)力與流體切應(yīng)力/HGF協(xié)同作用對(duì)永生化大鼠BRL-3A肝細(xì)胞株和HepG2肝癌細(xì)胞株增殖動(dòng)力學(xué)的影響：1.不同實(shí)驗(yàn)條件下永生化大鼠BRL-3A肝細(xì)胞株增殖動(dòng)力學(xué)的變化：1)Ao組與Bo組：大鼠永生化BRL-3A細(xì)胞株的細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)為時(shí)間依賴性。 同一時(shí)間點(diǎn),B組增殖明顯高于A組(P0.05)。2)同時(shí)間點(diǎn)Ao組和A12組與A24組比較：12 h-72 h間A12組和A24組的細(xì)胞增殖明顯高于A0(P0.05),A24組的細(xì)胞增殖明顯高于A12組(P0.05)：168 h時(shí),細(xì)胞增殖不明顯(P0.05)。3)同時(shí)間點(diǎn)Bo組和B12組與B24組比較：12 h-72 h間B12組和B24組的細(xì)胞增殖明顯高于B0(P0.05),B24組的細(xì)胞增殖明顯高于B12組(P0.05)：168h時(shí),細(xì)胞增殖不明顯(P0.05)。4)同時(shí)間點(diǎn)A12組與B12組,A24組合B24組比較：12 h-72 h間B12組的細(xì)胞增殖明顯高于A12組(P0.05)；B24組的細(xì)胞增殖明顯高于A24組(P0.05)；168 h時(shí),細(xì)胞增殖不明顯(P0.05)。5)同時(shí)間點(diǎn)A12組與A24組,B12組和B24組比較：12 h-72 h間A24組的細(xì)胞增殖明顯高于A12組(P0.05)；B24組的細(xì)胞增殖明顯高于B12組(P0.05)；168 h時(shí),細(xì)胞增殖不明顯(P0.05)；6)施加流體切應(yīng)力的組細(xì)胞均增殖明顯,且均在24 h到達(dá)增殖高峰,24 h-72 h逐漸下降,但仍高于對(duì)照組(P0.05)：168 h則與對(duì)照組水平接近或略高于對(duì)照組(P0.05)。2.不同實(shí)驗(yàn)條件下永生化人HepG2肝癌細(xì)胞株增殖動(dòng)力學(xué)的變化趨勢(shì)與永生化大鼠BRL-3A肝細(xì)胞株增殖動(dòng)力學(xué)的變化趨勢(shì)一致。全文結(jié)論(一)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：肝葉切除比例越大,PVP值升高越明顯；與之相應(yīng),肝組織PCNA和FAK的表達(dá)亦越明顯,且一致表現(xiàn)為24小時(shí)達(dá)到高峰值。隨著手術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng),在大鼠肝臟體積增長(zhǎng)接近正常大小的時(shí)候,各組PVP、PCNA和FAK的變化逐漸趨于一致。統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析結(jié)果提示肝葉切除比例的大小、PVP值的變化和PCNA、FAK的表達(dá)呈現(xiàn)一致性。說(shuō)明門(mén)靜脈血流力學(xué)的變化和FAK介導(dǎo)的力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)因素在肝再生過(guò)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。(二)流體切應(yīng)力對(duì)永生化大鼠BRL-3A肝細(xì)胞株和人HepG2肝癌細(xì)胞株的增殖有促進(jìn)作用,在生理可承受范圍內(nèi),流體切應(yīng)力越大,細(xì)胞增殖越明顯；在相同應(yīng)力大小作用下,添加HGF的細(xì)胞增殖高于未添加HGF的細(xì)胞。說(shuō)明在肝細(xì)胞增殖的過(guò)程中,力學(xué)因素和化學(xué)因素二者具有協(xié)同的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R657.3

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本文編號(hào)：2317126