發(fā)布時(shí)間：2018-10-31 14:05

【摘要】：目的 :分離培養(yǎng)髓核來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),比較不同氧濃度下細(xì)胞的生物學(xué)特性,探討氧濃度對(duì)椎間盤退變機(jī)制的影響。方法:用膠原酶消化法從手術(shù)摘除的4個(gè)腰椎間盤(椎間盤Pfirrmann分級(jí)為Ⅰ級(jí)或Ⅱ級(jí))髓核組織中分離MSCs,體外培養(yǎng)、傳代,觀察記錄細(xì)胞形態(tài)。取P3代細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀對(duì)分離得到的細(xì)胞表面抗原CD90、CD73、CD105、CD44和CD31、CD34、CD45的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè);用成骨、成脂、成軟骨培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞,分別在21d、28d、21d時(shí)用茜素紅、油紅O、甲苯胺藍(lán)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,觀察其成骨、成脂、成軟骨能力。在三氣培養(yǎng)箱的低氧條件(2%O_2、5%CO_2、37℃)和常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱的常氧條件(20%O_2、5%CO_2、37℃)下分別培養(yǎng)P3代細(xì)胞。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d時(shí)的細(xì)胞數(shù)量,比較不同氧濃度下細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線;使用Architect c8000自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)培養(yǎng)1d、2d、3d、4d、5d時(shí)培養(yǎng)基的pH值和滲透壓。實(shí)時(shí)熒光定量(q RT-PCR)檢測(cè)不同氧濃度培養(yǎng)下細(xì)胞的干性基因POU家族類別5同位序列1(POU5F1,OCT4)、NANOG同位序列(NANOG)、性別決定區(qū)Y盒2(SOX2)及擴(kuò)增基因細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1,CCND1)、MYC(c-Myc)、低氧誘導(dǎo)基因低氧誘導(dǎo)因子2α(HIF2α,EPAS1)、能量基因三磷酸腺苷合成酶(ATP5A1)、線粒體相關(guān)基因細(xì)胞色素c氧化酶Ⅳ亞基1型同工酶(COX4I1)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)、線粒體編碼細(xì)胞色素c氧化酶Ⅰ(MT-CO1)、MT-CO_2的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果:分離培養(yǎng)的細(xì)胞呈典型的單層貼壁生長(zhǎng),紡錘樣;P3代細(xì)胞免疫表型鑒定顯示MSCs表面分子標(biāo)記高表達(dá)CD90(80.4%)、CD73(99.9%)、CD105(99.8%)、CD44(95.9%),低表達(dá)CD31(5.3%)、CD34(4.4%)、CD45(6.8%);茜素紅、油紅O染色、甲苯胺藍(lán)染色證實(shí)細(xì)胞可向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化。根據(jù)國際干細(xì)胞治療協(xié)會(huì)(ISCT)有關(guān)MSCs的判定標(biāo)準(zhǔn),分離培養(yǎng)的細(xì)胞為髓核MSCs(NPMSCs)。低氧環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)更小,更接近原始MSCs,細(xì)胞增殖更快,低氧時(shí)倍增期為31.22±1.98h,常氧時(shí)倍增期為39.56±2.02h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。不同氧濃度各時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)基的pH值、滲透壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且皆在適合細(xì)胞生存的范圍。低氧培養(yǎng)下POU5F1(OCT4)、NANOG、SOX2、CCND1、MYC(c-Myc)、EPAS1、ATP5A1較常氧培養(yǎng)時(shí)顯著性升高(P0.05);COX4I1、TFAM、MT-CO1、MT-CO_2較常氧培養(yǎng)時(shí)顯著性降低(P0.05)。結(jié)論 :低氧條件下培養(yǎng)有利于人NPMSCs的細(xì)胞形態(tài)、干性基因、增殖能力等生物學(xué)活性的維持。
[Abstract]:Aim: to compare the biological characteristics of mesenchymal stem cells (MSCs),) isolated from nucleus pulposus under different oxygen concentrations and to explore the effect of oxygen concentration on the degeneration of intervertebral disc. Methods: MSCs, was isolated from four lumbar intervertebral discs (Pfirrmann grade 鈪，

本文編號(hào)：2302462