【摘要】：目的:通過(guò)研究低濃度過(guò)氧化氫(H2O2)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖、遷移、管腔形成等功能的影響,明確低濃度H2O2對(duì)HUVECs體外血管生成能力的生物學(xué)效應(yīng),進(jìn)而探討介導(dǎo)上述效應(yīng)的分子機(jī)制,為促進(jìn)臨床移植組織術(shù)后血管生成、增強(qiáng)移植物與受區(qū)之間血運(yùn)重建、改善移植物存活揭示新的治療靶點(diǎn)。方法:第一部分低濃度H202對(duì)HUVECs體外血管生成效應(yīng)的探討。①HUVECs體外培養(yǎng)與鑒定;②流式細(xì)胞儀分析不同濃度H202對(duì)HUVECs活性的影響,確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用H202濃度;③通過(guò)CCK-8試驗(yàn)、細(xì)胞劃痕愈合試驗(yàn)及Matrigel管腔結(jié)構(gòu)形成試驗(yàn)分析50μmol/L H2O2對(duì)HUVECs增殖、遷移及管腔形成能力的影響;④western blot分析50μmol/L H2O2對(duì)HUVECs中ERK5的活化效應(yīng)。本部分試驗(yàn)結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD),利用單因素方差分析行多組間比較,利用SNK事后檢驗(yàn)行進(jìn)一步兩兩比較,P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第二部分 ca-MEK5、ERK5 shRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株建立。①ca-MEK5真核表達(dá)載體構(gòu)建。構(gòu)建人ca-MEK5過(guò)表達(dá)慢病毒載體,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后western blot檢測(cè)Flag標(biāo)簽的表達(dá)情況,確認(rèn)表達(dá)后包裝慢病毒并感染HUVECs;②ERK5 shRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建。根據(jù)人ERK5基因序列設(shè)計(jì)并構(gòu)建shRNA載體,分別包裝慢病毒并感染HUVECs, real-time PCR和western blot檢測(cè)目的基因表達(dá)情況,篩選干擾效率最高者進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);③ca-MEK5、ERK5shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選及鑒定。第三部分低濃度H2O2促進(jìn)HUVECs體外血管生成的分子機(jī)制研究。①CCK-8試驗(yàn)、細(xì)胞劃痕愈合試驗(yàn)及Matrigel管腔結(jié)構(gòu)形成試驗(yàn)分析不同細(xì)胞接受50μmol/LH202刺激后,在增殖、遷移及管腔結(jié)構(gòu)形成能力方面的變化;②real-time PCR檢測(cè)不同細(xì)胞中VEGF mRNA水平;③ELISA法檢測(cè)不同細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF濃度。本部分試驗(yàn)結(jié)果表示為(x±SD),統(tǒng)計(jì)方法同第一部分。結(jié)果:第一部分①HUVECs在含10%FBS及1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中單層貼壁生長(zhǎng),匯合度接近100%時(shí)呈典型鋪路石/鵝卵石樣,內(nèi)皮細(xì)胞特異性表面標(biāo)記CD31陽(yáng)性;②不同濃度H2O2作用30min后,與對(duì)照組相比,25μmol/L、50μmol/L組細(xì)胞均無(wú)明顯凋亡,1 00μmol/L組細(xì)胞凋亡率有所上升,200μmol/L組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P0.05),將細(xì)胞較高的耐受濃度(50μmol/L)確定為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度;③與對(duì)照組相比,50μmol/LH202作用組HUVECs增殖、遷移及管腔結(jié)構(gòu)形成顯著增強(qiáng),過(guò)氧化氫酶Catalase可消除H2O2前述促血管生成作用;④與對(duì)照組相比,50μmol/L H2O2作用組HUVECs中p-ERK5水平顯著升高(P0.05)。第二部分①成功構(gòu)建ca-MEK5慢病毒載體,MOI20時(shí),HUVECs感染效率約為60%;②成功構(gòu)建并篩選ERK5shRNA慢病毒載體,MOI20時(shí),HUVECs感染效率約為70%;③兩種載體均攜帶嘌呤霉素抗性及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因,使用含嘌呤霉素培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)14天后,表達(dá)GFP的細(xì)胞比例均達(dá)90%以上;穩(wěn)轉(zhuǎn)株鑒定結(jié)果顯示:ca-MEK5過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株Flag標(biāo)簽表達(dá)陽(yáng)性,ERK5mRNA及蛋白水平無(wú)明顯變化,p-ERK5蛋白水平顯著增高(P0.05); ERK5 shRNA1穩(wěn)轉(zhuǎn)株中ERK5 mRNA及蛋白水平、p-ERK5蛋白水平均顯著降低(P0.05):相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞中ERK5、p-ERK5蛋白水平均無(wú)顯著變化。第三部分①細(xì)胞的增殖、遷移及管腔結(jié)構(gòu)形成(vs相應(yīng)對(duì)照組):50μμmol/LH2O2作用組HUVECs顯著增強(qiáng)(P0.05),ca-MEK5轉(zhuǎn)染組進(jìn)一步增強(qiáng)(P0.05),ERK5 shRNA轉(zhuǎn)染組顯著減弱(P0.05);②細(xì)胞中VEGF mRNA水平(vs相應(yīng)對(duì)照組):50 μmol/L H2O2作用組HUVECs顯著上升(P0.05),ca-MEK5轉(zhuǎn)染組進(jìn)一步升高(P0.05),ERK5 shRNA轉(zhuǎn)染組顯著降低(P0.05);③細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF水平(vs相應(yīng)對(duì)照組):50μmol/L H2O2作用組HUVECs顯著上升(P0.05), ca-MEK5轉(zhuǎn)染組進(jìn)一步升高(P0.05), ERK5 shRNA轉(zhuǎn)染組顯著降低(P0.05)。結(jié)論:低濃度H202 (50μmol/L)能夠促進(jìn)HUVECs的增殖、遷移及管腔結(jié)構(gòu)形成,ERK5為介導(dǎo)H2O2上述促進(jìn)HUVECs體外血管生成效應(yīng)所必需。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R622

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳建勇;王聰;王娟;曹禮榮;;MAPK信號(hào)通路研究進(jìn)展[J];中國(guó)醫(yī)藥科學(xué);2011年08期

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本文編號(hào)：2301290