【摘要】：背景和目的:肌衛(wèi)星細(xì)胞是骨骼肌組織內(nèi)最主要的干細(xì)胞成分,它通過(guò)激活轉(zhuǎn)化為具有增殖分化能力的成肌細(xì)胞負(fù)責(zé)骨骼肌的生后生長(zhǎng)和損傷后再生,是骨骼肌損傷再生和可塑性的主要細(xì)胞基礎(chǔ)。近幾年研究顯示細(xì)胞能量代謝在干細(xì)胞的自我更新、增殖分化中具有重要調(diào)控作用,肌衛(wèi)星細(xì)胞在增殖分化進(jìn)程中也呈現(xiàn)了顯著的能量代謝模式的改變。腺苷酸活化的蛋白激酶(AMPK)是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵感受和調(diào)控分子,活化的AMPK一方面抑制消耗ATP的合成代謝途徑,同時(shí)啟動(dòng)產(chǎn)生ATP的細(xì)胞內(nèi)分解代謝,最終恢復(fù)或維持細(xì)胞能量代謝的平衡。本課題以AMPK為研究重點(diǎn),首先觀察了激活A(yù)MPK對(duì)成肌細(xì)胞C2C12增殖分化及線粒體功能活性等性狀的影響,然后基于前期報(bào)道觀察了熱量限制對(duì)老年骨骼肌及肌衛(wèi)星細(xì)胞AMPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。以深入闡明代謝因素參與干細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的可能機(jī)制,探討AMPK信號(hào)途徑對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化潛能的調(diào)節(jié)作用,發(fā)掘促進(jìn)老年骨骼肌組織損傷再生的潛在分子靶位。方法:1.C2C12細(xì)胞的培養(yǎng)C2C12成肌細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC公司,細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,分化培養(yǎng)基為含2%馬血清的低糖DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱溫度37℃,CO2濃度5%。2.二甲雙胍處理后C2C12細(xì)胞AMPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)C2C12細(xì)胞在含二甲雙胍(終濃度1mmol/L)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)12h、24h、36h和48h后,WB檢測(cè)p-AMPKα、AMPKα和SIRT1蛋白表達(dá)變化。3.誘導(dǎo)AMPK活化后C2C12細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)C2C12細(xì)胞在含二甲雙胍(終濃度1mmol/L)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng),CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)培養(yǎng)0h、24h、48h后細(xì)胞增殖狀態(tài),流式細(xì)胞周期分別檢測(cè)培養(yǎng)24h和48h后細(xì)胞周期的變化,同時(shí)以5-乙炔基-2-脫氧尿苷(Edu)摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)培養(yǎng)48h后DNA合成情況。4.誘導(dǎo)AMPK活化后C2C12細(xì)胞肌原性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及肌管形成的檢測(cè)(1)C2C12細(xì)胞在含二甲雙胍(終濃度1mmol/L)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng),WB分別檢測(cè)培養(yǎng)12h、24h、36h和48h后細(xì)胞Pax7蛋白表達(dá)變化,Real-Time PCR分別檢測(cè)培養(yǎng)24h和48h后細(xì)胞MyoD m RNA表達(dá)變化。(2)C2C12細(xì)胞首先在含二甲雙胍(終濃度1mmol/L)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中預(yù)處理48h,然后在分化培養(yǎng)基條件下誘導(dǎo)其分化,通過(guò)Real-Time PCR分別檢測(cè)誘導(dǎo)24h、48h和72h后Myogenin mRNA的表達(dá),同時(shí)以吉姆薩染色檢測(cè)誘導(dǎo)72h后肌管形成情況,計(jì)算肌管融合指數(shù)(含2個(gè)以上細(xì)胞核的肌管比例)。5.誘導(dǎo)AMPK活化后C2C12細(xì)胞線粒體膜電位的檢測(cè)C2C12細(xì)胞在含二甲雙胍(終濃度1mmol/L)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng),通過(guò)流式細(xì)胞儀以JC-1線粒體膜電位探針?lè)謩e檢測(cè)培養(yǎng)24h和48h后細(xì)胞線粒體膜電位變化,同時(shí)以四甲基羅丹明乙酯(TMRE)線粒體膜電位探針于激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)培養(yǎng)24h后細(xì)胞線粒體膜電位變化。6.誘導(dǎo)AMPK活化后C2C12細(xì)胞線粒體分布、生成以及PGC1α表達(dá)的檢測(cè)C2C12細(xì)胞在含二甲雙胍(終濃度1mmol/L)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng),通過(guò)Mito-Tracker Green探針標(biāo)記細(xì)胞線粒體,然后通過(guò)激光共聚焦和流式分別檢測(cè)細(xì)胞線粒體分布及生成情況。同時(shí)以WB檢測(cè)細(xì)胞PGC1α蛋白表達(dá)變化,以Real-Time PCR分別檢測(cè)細(xì)胞PGC1αmRNA表達(dá)變化。7.熱量限制動(dòng)物模型的建立13月齡雄性C57BL/6小鼠30只,按照簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法分為兩組:自由進(jìn)食組和40%熱量限制組,單籠飼養(yǎng),自由飲水,一只熱量限制小鼠一周進(jìn)食量=自由進(jìn)食組小鼠平均每只一周進(jìn)食量×60%,平均分至每天,熱量限制12周。8.熱量限制后小鼠骨骼肌AMPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)WB檢測(cè)熱量限制后小鼠脛前肌p-AMPKα、AMPKα和SIRT1蛋白表達(dá)變化。9.熱量限制后小鼠骨骼肌線粒體形態(tài)的觀察以及PGC1α蛋白表達(dá)的檢測(cè)透射電鏡觀察熱量限制后脛前肌線粒體形態(tài)的變化,分別計(jì)算線粒體的密度、長(zhǎng)度及寬度,WB檢測(cè)脛前肌PGC1α蛋白表達(dá)變化。10.熱量限制后小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞AMPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離通過(guò)膠原酶和中性蛋白酶消化,然后通過(guò)多重?zé)晒鈽?biāo)記進(jìn)行流式分選,其中CD45-/CD11b-/Sca-1-/CXCR4+/CD29+細(xì)胞為肌衛(wèi)星細(xì)胞;分選的細(xì)胞提取總蛋白,然后通過(guò)ELISA分別檢測(cè)p-AMPKα、SIRT1和PGC1α表達(dá)變化。結(jié)果:1.C2C12細(xì)胞在二甲雙胍處理24h后,AMPKα的磷酸化水平即顯著升高(p0.05);SIRT1蛋白表達(dá)在處理組顯著上調(diào),處理48h后與對(duì)照組差異最為明顯(p0.05)。2.二甲雙胍誘導(dǎo)AMPK活化后,通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察顯示C2C12細(xì)胞增殖速度明顯減慢,OD450nm在48h時(shí)較對(duì)照組顯著下降(p0.01);同時(shí)細(xì)胞周期也表現(xiàn)出明顯變化,S期細(xì)胞比例隨處理時(shí)間不斷升高,48h時(shí)較對(duì)照組差異顯著(p0.05),而G2/M期細(xì)胞比例則不斷減少;DNA合成檢測(cè)結(jié)果顯示,Edu陽(yáng)性細(xì)胞比例在二甲雙胍處理48h后與對(duì)照組相比增加明顯(p0.01)。3.二甲雙胍處理24h后,C2C12細(xì)胞Pax7蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著升高(p0.01),并在此后的處理期間一直維持較高表達(dá)水平;MyoD m RNA表達(dá)在處理48h后,與對(duì)照組相比下降明顯(p0.01);C2C12細(xì)胞通過(guò)二甲雙胍預(yù)處理后,分化條件下Myogenin m RNA的表達(dá)在各檢測(cè)點(diǎn)均較低,誘導(dǎo)72h后,Myogenin m RNA表達(dá)和肌管融合指數(shù)較對(duì)照組均顯著下降(均為p0.01)。4.通過(guò)兩種不同線粒體膜電位探針檢測(cè)結(jié)果顯示,二甲雙胍處理24h后C2C12細(xì)胞線粒體膜電位較對(duì)照組下降明顯(均為p0.01)。5.Mito-Tracker Green標(biāo)記檢查結(jié)果可以明顯的觀察到二甲雙胍處理48h后C2C12細(xì)胞線粒體趨向核周聚集分布,同時(shí)線粒體平均熒光強(qiáng)度較對(duì)照組顯著升高(p0.01);蛋白及m RNA檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,C2C12細(xì)胞在二甲雙胍處理24h后PGC1α蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)均顯著升高(分別為p0.01和p0.05)。6.與對(duì)照組相比,熱量限制小鼠骨骼肌AMPKα磷酸化水平顯著上調(diào)(p0.01),SIRT1蛋白表達(dá)也明顯升高(p0.01)。7.與對(duì)照組相比,熱量限制鼠骨骼肌線粒體密度明顯升高(p0.01),體積明顯增大(長(zhǎng)度:p0.05,寬度:p0.01);同時(shí)PGC1α蛋白表達(dá)也顯著上調(diào)(p0.05)。8.熱量限制鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞p-AMPKα、SIRT1以及PGC1α表達(dá)較對(duì)照組均明顯升高(分別為p0.01;p0.05;p0.05)。結(jié)論:1.二甲雙胍能夠激活C2C12細(xì)胞AMPK信號(hào)通路,促進(jìn)其下游去乙酰化酶SIRT1等蛋白表達(dá)的上調(diào)。2.二甲雙胍能夠抑制C2C12細(xì)胞增殖,使其細(xì)胞周期阻滯于S期;同時(shí)能夠上調(diào)Pax7蛋白的表達(dá),下調(diào)MyoD基因的轉(zhuǎn)錄水平,在分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)條件下抑制其定向分化,從而維持C2C12細(xì)胞的低分化狀態(tài)。這些影響可能依賴于二甲雙胍處理后C2C12細(xì)胞內(nèi)AMPK通路的活化及其相關(guān)蛋白表達(dá)的上調(diào)。3.通過(guò)二甲雙胍激活A(yù)MPK能夠引起C2C12細(xì)胞線粒體膜電位的下降,提示細(xì)胞能量代謝水平的下調(diào);同時(shí)伴隨PGC1α轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的上調(diào),線粒體生成增多且呈現(xiàn)向核分布。進(jìn)一步提示二甲雙胍可能通過(guò)AMPK的活化及相關(guān)蛋白表達(dá)的上調(diào)維持C2C12細(xì)胞的靜息狀態(tài)。4.熱量限制能夠激活骨骼肌AMPK通路,上調(diào)AMPK相關(guān)蛋白表達(dá),促進(jìn)骨骼肌內(nèi)線粒體生成,從而改善老年骨骼肌微環(huán)境,同時(shí)還能促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞內(nèi)AMPK通路的上調(diào)。結(jié)合前期研究,提示熱量限制可能通過(guò)上調(diào)AMPK通路維持老年肌衛(wèi)星細(xì)胞干細(xì)胞屬性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R685

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本文編號(hào)：2297696