【摘要】：背景:瘢痕是人體創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程的一種自然產(chǎn)物,其中病理性瘢痕則是皮膚損傷后創(chuàng)面過(guò)度修復(fù)引起以大量ECM合成及沉積為特征的皮膚纖維化疾病。它主要包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩,其中增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)在臨床中非常多見(jiàn),其表現(xiàn)為突出皮膚表面或呈持續(xù)生長(zhǎng)的亢奮狀態(tài)。大量研究表明,TGF-β是促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)及瘢痕形成的關(guān)鍵效應(yīng)因子,TGF-β的生物活性的發(fā)揮主要通過(guò)Smads家族介導(dǎo)的。而TGF-β/Smad信號(hào)通路主要通過(guò)活化的TGF-β與其胞膜TβRII(TGFβ-receptor II)相結(jié)合,促使TβRI(TGFβ-receptor I)與TβRII形成受體異聚體,隨后TβRI的GS區(qū)磷酸化,激活TβRI,與Smad2和Smad3形成TβRI-SARA-Smads復(fù)合體,隨后將Smad2和Smad3磷酸化,與Smad4形成異源復(fù)合物轉(zhuǎn)入細(xì)胞核,最終調(diào)控成纖維細(xì)胞的增值、分化及膠原代謝,促進(jìn)增生性瘢痕形成。由此可見(jiàn)TβRI是TGF-β/Smad信號(hào)通路的關(guān)鍵組分。不僅如此,抑制型蛋白Smad7是TGF-β/Smad信號(hào)通路的主要負(fù)性調(diào)節(jié)因子,Smad7通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)著正性與負(fù)性Smads之間的平衡。近年來(lái)研究表明,泛素特異性蛋白酶4(USP4)可增強(qiáng)TGF-β信號(hào)通路的水平,但在HS形成中,USP4對(duì)TGF-β信號(hào)通路的作用還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)就從組織水平及細(xì)胞水平研究USP4對(duì)瘢痕形成的調(diào)控作用,為瘢痕的防治探索新方法。目的:探討USP4在HS形成中的重要作用,尤其是TGF-β/Smad信號(hào)通路的調(diào)控作用;通過(guò)泛素特異性蛋白酶抑制劑(Vialinin A)抑制USP4表達(dá),明確USP4與TβRI、Smad7的相關(guān)性,闡明USP4對(duì)增生性瘢痕的作用機(jī)制,為臨床上利用USP4作為藥物作用靶點(diǎn)治療HS提供重要的理論依據(jù)。方法:1、取本院整形外科臨床上增生性瘢痕患者的HS標(biāo)本以及瘢痕周圍正常皮膚組織標(biāo)本15例(傷后6個(gè)月~1年內(nèi)),低溫下迅速帶回實(shí)驗(yàn)室處理;部分組織生理鹽水洗凈后用4%中性甲醛固定后,常規(guī)脫水和石蠟包埋,進(jìn)行免疫組化檢測(cè);部分組織用于Western blot檢測(cè)人增生性瘢痕組織中USP4及TβRI蛋白表達(dá)水平差異,并以正常皮膚組織(Normal tissue,NS)作為對(duì)照。2、收集人增生性瘢痕組織及瘢痕周圍正常皮膚標(biāo)本,采用改良組織塊聯(lián)合胰酶消化法體外培養(yǎng)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(Hypertrophic scar fibroblast,HSFB)和正常皮膚成纖維細(xì)胞(Normal skin fibroblast,NSFB)。①取第4代FB(Fibroblast),Western blot檢測(cè)HSFB與NSFB中USP4、TβRI和Smad7蛋白表達(dá)水平;②人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞鋪板培養(yǎng)24h后加入5μmol/LVialinin A(USP4抑制劑),在0h、12h、24 h、48h后收取細(xì)胞,運(yùn)用Western blot再次檢測(cè)USP4、TβRI及Smad7蛋白的表達(dá)水平;③人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞以每孔1×104/ml密度接種于96孔板培養(yǎng)24h后加入5μmol/L Vialinin A,MTT法檢測(cè)Vialinin A對(duì)HSFB增殖的影響,并以未干預(yù)的細(xì)胞作為對(duì)照。結(jié)果:1、免疫組化結(jié)果顯示:USP4在NS中表皮基底細(xì)胞中有少量陽(yáng)性表達(dá),FB中未見(jiàn)明顯陽(yáng)性表達(dá),在HS中除了表皮基底細(xì)胞外,FB胞膜及胞漿中存在大量的陽(yáng)性表達(dá),兩者比較具有差異(P0.01);TβRI在NS中FB中基本不著色,在HS中FB胞膜及胞漿可見(jiàn)大量陽(yáng)性表達(dá),兩者比較具有顯著差異(P0.01)。2、Western Blot結(jié)果顯示:USP4及TβRI在HS高表達(dá),USP4及TβRI在NS表達(dá)水平較低,兩者比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P0.05);USP4及TβRI在HSFB中的蛋白表達(dá)較NSFB的高((P0.05),而Smad7蛋白在HSFB中低表達(dá)(P0.05);加入Vialinin A后,隨著時(shí)間推移,USP4及TβRI蛋白在HSFB中的表達(dá)水平逐漸降低,在作用12h后明顯降低(P0.05),Smad7蛋白的表達(dá)則逐漸升高(P0.05),進(jìn)一步證實(shí)USP4與TβRI正相關(guān),與Smad7負(fù)相關(guān)。3、MTT結(jié)果顯示:加入Vialinin A后的HSFB與未被干預(yù)的HSFB相比,增殖活性降低(P0.05)。結(jié)論:1、增生性瘢痕組織及細(xì)胞中USP4及TβRI蛋白明顯增高,Smad7在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞低表達(dá)。2、下調(diào)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中USP4表達(dá)能夠顯著降低TβRI的表達(dá),上調(diào)Smad7的表達(dá),提示USP4可能通過(guò)調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)通路影響瘢痕組織形成。3、下調(diào)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中USP4表達(dá)能夠使增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖減慢,有望為瘢痕的防治提供新思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R622

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 李衍常;高媛;徐忠偉;蘭秋艷;徐平;;蛋白質(zhì)組學(xué)在去泛素化酶研究中的應(yīng)用[J];生物工程學(xué)報(bào);2014年09期

2 劉愛(ài)東;王s，

本文編號(hào)：2264074