【摘要】：肝臟是人體內(nèi)最大的消化腺,發(fā)揮重要的生理功能。正常情況下肝再生不明顯,當肝臟受到損傷時,則表現(xiàn)出強大的再生能力,這對于急、慢性肝損傷后肝臟修復具有重要的意義。參與肝再生的細胞種類與肝臟受損的狀態(tài)(如受損原因、炎癥輕重、肝纖維化程度等)密切相關(guān)：當輕度受損時,主要以肝實質(zhì)細胞的增殖修復為主;當肝臟損傷嚴重或慢性肝損傷時,肝實質(zhì)細胞增殖受抑制,則以肝干細胞激活、增殖和分化為主。肝卵圓細胞(Hepatic oval cell,HOC)被認為是主要的肝干細胞,正常情況下,肝臟中肝卵圓細胞非常少;當肝臟受損嚴重、正常肝實質(zhì)細胞增殖被抑制時,肝卵圓細胞被激活,進一步增殖、分化為肝細胞和膽管上皮細胞,以完成肝臟的修復和再生。大鼠2-AAF(2-acetylaminofluorene,2-乙酰氨基芴)/PHx(Partial Hepatectomy,部分肝切除術(shù))模型是最常用的肝卵圓細胞誘導模型,在這個模型中肝細胞增殖被2-AAF抑制,部分肝切除術(shù)后肝再生通過肝卵圓細胞增殖分化完成。多年來對肝再生機制的研究主要集中在細胞因子、化學信號傳導通路方面。近年來,血流力學信號在肝再生機制研究方面的作用逐漸受到人們的重視。從肝再生的精細調(diào)節(jié)過程來看,門靜脈血流變化似乎是啟動、維持,甚至是終止肝再生過程的重要因素。但是肝再生是一個極其復雜的過程,涉及多種因子和信號通路的共同調(diào)控,其具體機制尚未完全闡明。部分肝切除術(shù)后,肝臟微環(huán)境血流力學改變可能通過細胞外基質(zhì)與細胞之間的力學相互作用調(diào)控肝再生。黏著斑激酶(Focal Adhesion Kinase,FAK)介導的“細胞外基質(zhì)(ExtracellularMatrix,ECM)-整合素-細胞骨架(Cytoskeleton,CSK)”信號途徑被認為是力學信號轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵通路,FAK被認為是該力學信號通路的啟動子,是不同機械力作用于細胞啟動力學信號傳導的關(guān)鍵點。力學作用下,FAK被激活,將力學信號通過整合素、細胞骨架轉(zhuǎn)導至細胞內(nèi),進一步激活下游信號通路,參與細胞增殖過程。我們前期的研究(國家自然科學基金,項目編號:40110011,應力刺激對肝再生的影響及其Ras/MAPK信號途徑調(diào)節(jié)機制的研究)發(fā)現(xiàn):大鼠部分肝切除術(shù)后,門靜脈壓力變化、力學信號傳導通路關(guān)鍵蛋白FAK表達量和肝組織中增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)表達量三者之間呈正相關(guān)關(guān)系,說明部分肝切除術(shù)后流體應力變化可能通過力學信號通路關(guān)鍵蛋白FAK刺激肝細胞增殖。在肝臟受到嚴重損傷或慢性損傷時,肝干細胞參與肝再生過程,血流力學變化對肝卵圓細胞增殖和分化的影響尚不清楚,本課題擬對這一問題進行研究。[目的]本實驗擬建立SD(Sprague Dawley)大鼠2-AAF/PHx肝卵圓細胞增殖誘導模型,動態(tài)測量門靜脈壓力(Portal Venous Pressure,PVP)值,半定量免疫組化分析肝組織中CK19、PCNA表達量的變化(PCNA可反映細胞的增殖活性,CK19可作為肝卵圓細胞的標記物),探討血流力學變化對大鼠肝卵圓細胞增殖活性的影響。[方法]1.SD大鼠2-AAF/PHx動物模型的建立及實驗分組1.1以SPF級雄性SD大鼠為研究對象,共24只,體重250±25g,飼養(yǎng)溫度約25℃,相對濕度約60%,光照時間12h/d,自由飲水、攝食;1.2大鼠隨機分為A、B、C、D組,每組6只,按每只20mg/(kg·d)2-AAF連續(xù)灌喂6天,第7天A組進行假手術(shù),只游離肝周韌帶;B組行30%肝切除術(shù),C組行50%肝切除術(shù),D組行70%肝切除術(shù);術(shù)后第1天,繼續(xù)灌喂2-AAF(劑量同術(shù)前)至術(shù)后3天結(jié)束。2.門靜脈壓力測定及肝組織標本的免疫組化檢測術(shù)后72h再次腹腔注射麻醉下,沿上腹部切口進腹,門靜脈穿刺標尺法測量門靜脈壓力(PVP)值(單位:cmH2O)。頸椎脫臼處死大鼠后留取肝組織標本,立即放入10%中性甲醛,固定24h,常規(guī)石蠟包埋、切片,PCNA和CK19免疫組化染色檢測。3.檢測指標統(tǒng)計各組大鼠門靜脈壓力值;肝組織標本免疫組化結(jié)果,每張切片隨機選擇相鄰的5個視野采圖,用Image-pro plus 6.0醫(yī)學圖像分析軟件分別檢測每張病理圖片中免疫組化染色陽性的平均光密度值(IOD),表示CK19、PCNA的相對表達量。4.統(tǒng)計學分析測量結(jié)果以平均數(shù)±標準差(x±s)表示,實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行方差分析,兩兩比較采用LSD法,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。[結(jié)果]1.各組門靜脈壓力(PVP)值變化隨著肝切除比例的增加,門靜脈壓力逐漸增大,方差分析總體比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=100.214,P0.05);各組之間相互比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.PCNA表達量變化隨著肝切除比例的增加,PCNA表達量逐漸增加,方差分析總體比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=32.825,P0.05);70%肝切除術(shù)組PCNA表達量最顯著,與其余各組之間比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);50%肝切除術(shù)組與對照組比較,差異也具有統(tǒng)計學意義(P0.05),但沒有70%肝切除術(shù)組與對照組比較差異顯著;30%肝切除術(shù)組與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.CK19表達量變化隨著肝切除比例的增加,CK19表達量也逐漸增加,方差分析總體比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=13.072,P0.05);70%肝切除術(shù)組CK19表達量最顯著,與其余各組之間比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);50%肝切除術(shù)組與對照組比較,差異也具有統(tǒng)計學意義(P0.05),但沒有70%肝切除術(shù)組與對照組比較差異顯著;而30%肝切除組與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。[結(jié)論]對照組、30%肝切除術(shù)組、50%肝切除術(shù)組、70%肝切除術(shù)組隨著肝切除比例的增加,門靜脈壓力逐漸升高,肝卵圓細胞的增殖活性(PCNA、CK19表達量)也逐漸增強。其中70%肝切除術(shù)組中肝卵圓細胞增殖活性最顯著,與其余各組比較差異具有統(tǒng)計學意義;50%肝切除術(shù)組與對照組比較差異也有統(tǒng)計學意義,但差異沒有70%肝切除術(shù)組與對照組比較顯著;而30%肝切除術(shù)組與對照組比較,肝卵圓細胞增殖活性差異無統(tǒng)計學意義。說明門靜脈壓力增加達一定程度時,血流力學增加可促進肝卵圓細胞的增殖,但是肝卵圓細胞增殖活性除了與血流力學變化相關(guān)外,可能與肝臟損傷的輕重程度也相關(guān),其具體的作用機制還需要進—步研究。
[Abstract]:In this model , hepatic oval cell ( HOC ) is considered to be the main hepatic stem cell . In this study , the effects of hepatic stem cells on the proliferation and differentiation of hepatic oval cells were studied . The effects of changes of hepatic stem cells on the proliferation and differentiation of hepatic oval cells were investigated . Methods : 1 . The establishment of 2 - AAF / PHx animal model of SD rats and the experimental group 1.1 were studied by SPF male SD rats . The rats were randomly divided into three groups : group A , B , C and D . Compared with the control group , there was no significant difference in the expression of CK19 ( P 0.05 ) , but no significant difference was found between the 70 % hepatectomy group and the control group ( P0.05 ) . Compared with the control group , there was no significant difference in the proliferation activity of hepatic oval cells compared with the control group , but the proliferation activity of hepatic oval cells was not significantly different from that of the control group .
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R657.3

【參考文獻】

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本文編號：2120598