發(fā)布時間：2018-07-05 16:06

  本文選題：成骨細胞 + 誘導分化��； 參考：《廣西醫(yī)科大學》2015年博士論文

【摘要】：骨重建是一個骨質(zhì)分解及合成代謝的動態(tài)過程,并且貫穿人的一生。據(jù)報道,在成年人當中每年約10%的骨骼經(jīng)歷重建和再生；承擔此任務的主要是兩類細胞：負責骨質(zhì)吸收的破骨細胞和參與骨質(zhì)合成的成骨細胞。破骨細胞來源于單核巨噬細胞系(BMMs)中的造血干細胞,成熟的破骨細胞是一種具有骨吸收功能的多核巨細胞。破骨細胞的增殖、分化及成熟受到兩個關鍵的細胞因子所調(diào)控：巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF),核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)。 M-CSF主要作用于單核巨噬細胞使其向破骨前體細胞分化增殖,并促進破骨前體細胞特異性表達核因子-κB受體活化因子(RANK),同時還參與成熟破骨細胞的活化、黏附及遷徙。RANKL是一種Ⅱ型膜聯(lián)蛋白,屬于腫瘤壞死因子配體家族。在與其特異性受體RANK結合后,在M-CSF的協(xié)同作用下,RANKL對破骨細胞的進一步分化及發(fā)揮骨吸收功能起決定性作用。成骨細胞來源于間充質(zhì)干細胞,分化成熟的成骨細胞能夠分泌膠原和糖蛋白,并產(chǎn)生細胞外骨基質(zhì)及礦化組織。同時在骨骼微環(huán)境內(nèi),成骨細胞在分化成熟過程中分泌大量細胞因子,從而影響破骨細胞的分化及功能。如上所述,對破骨細胞分化成熟起關鍵性作用的RANKL和M-CSF主要來源于成骨細胞；此外,成骨細胞還分泌Ⅰ型膠原及骨鈣素等化學趨化因子,調(diào)節(jié)破骨前體細胞的遷徙。在1997-1998年間,RANKL首次被克隆合成并證實其參與調(diào)節(jié)對破骨細胞的分化融合及骨吸收功能。RANKL基因編碼兩種不同功能的蛋白形式：兩種形式的Ⅱ型膜聯(lián)蛋白(RANKL1/2)和一種分泌性蛋白(RANKL3)。其中與破骨細胞表面特異性RANK受體結合的是RANKL1 。 RANKL在全身多個組織器官中都有較高的表達,如乳腺、胸腺及肺臟等。在骨骼系統(tǒng)中,成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞為RANKL的主要來源。此外,RANKL的分泌還受到多種激素或細胞因子的影響：如甲狀旁腺激素、前列腺素E2、腫瘤壞死因子a、白介素-1/6/11、1-25-(2)羥基維生素D3等可以上調(diào)RANKL的分泌水平；而雌激素、雄性激素、轉移生長因子-p及干擾素-γ則對RANKL的分泌起抑制作用。目前大量文獻表明,RANKL介導的破骨細胞功能亢進與各種類型的病理性骨溶解有著密切關系,例如：腫瘤導致的骨質(zhì)破壞、炎癥性的骨溶解、人工關節(jié)置換術后無菌性假體松動、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、Paget's病、銀屑病性關節(jié)炎及強直性脊柱炎等等。因此,RANKL作為治療破骨細胞相關性骨溶解的一個理想靶點,在臨床應用上有著廣闊的前景。花色苷作為一種水溶性色素,是構成植物王國中果實和花瓣顏色的主要成分之一；作為花青素的糖苷化形式,花色苷屬于黃酮類�；ㄇ嗨氐幕净瘜W結構為2一苯基苯并吡喃,是一種陽離子�；ㄇ嗨厥且环N酚類化合物,其包括以下六個亞型：飛燕草色素、矢車菊素、牽牛花色素、天竺葵色素、芍藥色素和錦葵色素。此外,花青素可以直接口服并迅速進入全身血液循環(huán),因此其具有很高的生物利用率。近年來,大量文獻報道花青素及花色苷具有抗腫瘤,抗炎癥反應和抗氧化應激等方面的活性。矢車菊素被認為是花青素化合物在自然界中分布最廣的亞型,其主要分布于各種蔬菜、瓜果、豆類及紅酒之中；在歐美等國家成人平均每日攝入量在10mg以上,相關報道亦證實長期攝入矢車菊素具有降低癌癥、心血管疾病和糖尿病等發(fā)病率的作用。盡管國內(nèi)外大量研究已經(jīng)對矢車菊素的化學活性,治療相關疾病的臨床前期研究及其機制做了較為詳細的闡述；但是上述報道主要針對矢車菊素的糖苷形式(C3G:cyanidin-3-glycoside)。然而作為矢車菊素的氯化物單體形式,氯化矢車菊素(Cyanidin Chloride, CY)僅被報道具有保護水楊酸類藥物引起的胃腸粘膜損傷作用。到目前為止,關于氯化矢車菊素在溶骨性疾病的治療效果及其相關機制的研究未見報道。本實驗通過細胞生物學和現(xiàn)代分子生物學技術,在體外環(huán)境中觀察氯化矢車菊素對破骨細胞的增殖、分化及骨吸收功能的影響；并在分子水平上探究其可能的影響機制。進而,通過構建卵巢切除所致的骨質(zhì)疏松小鼠動物模型,進一步驗證氯化矢車菊素在體內(nèi)實驗中對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥等破骨細胞所致溶骨性疾病的療效。實驗內(nèi)容包括以下三個部分：第一部分骨髓單核巨噬細胞的分離和培養(yǎng),及向破骨細胞定向誘導分化模型的建立和破骨細胞的生物學性狀分析目的：建立以小鼠骨髓單核細胞為來源的破骨細胞體外分離培養(yǎng)體系,通過形態(tài)學特點及骨吸收功能等方面對破骨細胞進行鑒定。方法：通過全骨髓細胞貼壁法分離提取骨髓單核細胞(BMMs)。之后在M-CSF和RANKL的刺激下,進行骨髓造血細胞體外培養(yǎng)、擴增,并誘導其向破骨細胞定向分化。通過細胞形態(tài)學觀察,抗酒石酸酸性磷酸酶染色及骨吸收能力的檢測等方法對破骨細胞進行鑒定,以確定骨髓單核細胞體外分離培養(yǎng)體系向破骨細胞分化的能力及穩(wěn)定性。結果：在M-CSF作用下,骨髓細胞呈長梭形,以貼壁方式生長,增殖旺盛。加入RANKL刺激后,細胞逐步分化融合為空泡狀多核巨細胞,即成熟的破骨細胞。該多核巨細胞在抗酒石酸酸性磷酸酶染色時呈陽性反應；并且具有骨吸收功能,能在皮質(zhì)骨板上形成骨吸收陷窩。結論：骨髓細胞貼壁培養(yǎng)及M-CSF/RANKL聯(lián)合刺激培養(yǎng)體系可以提供穩(wěn)定且充足的破骨細胞,對進一步體外藥物干預實驗具有重要意義。第二部分 成骨細胞分離培養(yǎng)模型的建立,及生物學性狀分析目的：小鼠原代成骨細胞的分離提取、培養(yǎng)、形態(tài)學觀察及功能鑒定。方法：取新鮮小鼠顱蓋骨,剪碎并碾磨后經(jīng)胰酶替代物消化；消化液離心,棄上清液后以含15%小牛血清的DMEM溶液培養(yǎng)于12孔細胞培養(yǎng)板；待細胞鋪滿后加入誘導分化液。最后,對分化成熟的細胞進行堿性磷酸酶活性及鈣結節(jié)檢測以鑒定其生物學特性。結果：成熟的成骨細胞為梭形,貼壁生長并能形成細胞突觸,生長旺盛。加入分化液,經(jīng)過7天誘導分化后能產(chǎn)生大量堿性磷酸酶,堿性磷酸酶染色陽性；經(jīng)過2周分化液培養(yǎng)后能在細胞培養(yǎng)板上形成礦化結節(jié),即鈣結節(jié)。結論：從小鼠顱骨分離提取原代成骨細胞,并用分化液在體外誘導分化成熟,是穩(wěn)定可靠的成骨細胞分離培養(yǎng)體系。第二部分 成骨細胞分離培養(yǎng)模型的建立,及生物學性狀分析目的：小鼠原代成骨細胞的分離提取、培養(yǎng)、形態(tài)學觀察及功能鑒定。方法：取新鮮小鼠顱蓋骨,剪碎并碾磨后經(jīng)胰酶替代物消化；消化液離心,棄上清液后以含15%小牛血清的DMEM溶液培養(yǎng)于12孔細胞培養(yǎng)板；待細胞鋪滿后加入誘導分化液。最后,對分化成熟的細胞進行堿性磷酸酶活性及鈣結節(jié)檢測以鑒定其生物學特性。結果：成熟的成骨細胞為梭形,貼壁生長并能形成細胞突觸,生長旺盛。加入分化液,經(jīng)過7天誘導分化后能產(chǎn)生大量堿性磷酸酶,堿性磷酸酶染色陽性；經(jīng)過2周分化液培養(yǎng)后能在細胞培養(yǎng)板上形成礦化結節(jié),即鈣結節(jié)。結論：從小鼠顱骨分離提取原代成骨細胞,并用分化液在體外誘導分化成熟,是穩(wěn)定可靠的成骨細胞分離培養(yǎng)體系。第三部分 氯化矢車菊素對卵巢切除所致骨溶解的療效及其分子機制目的：觀察氯化矢車菊素對卵巢切除所致骨溶解及RANKL介導的破骨細胞過度生長的作用,并闡明其分子機制。方法：建立卵巢切除動物模型,通過Micro-CT及病理學檢查結果對骨骼形態(tài)學、破骨細胞的參數(shù)進行比較分析,觀察氯化矢車菊素對卵巢切除所致骨溶解的療效。通過骨髓單核細胞體外分離培養(yǎng),TRAP染色及細胞計數(shù)、MTS細胞活力測定和流式細胞儀凋亡檢測、骨吸收實驗等,分別檢測氯化矢車菊素對破骨細胞的形成及骨吸收功能的影響,同時觀察其對破骨前體細胞的細胞毒性；進而借助實時熒光定量RT-PCR檢測、Western-blot蛋白印跡測量、Luciferase螢光素酶報告基團系統(tǒng)分析、鈣離子震蕩、酸化實驗等方法,探究氯化矢車菊素對破骨細胞分化及骨吸收功能的調(diào)控機制和所涉及的細胞信號傳導通路。此外通過成骨細胞體外分離培養(yǎng)體系,觀察氯化矢車菊素對成骨細胞功能的影響。結果：氯化矢車菊素能有效地緩解卵巢切除所導致的小鼠全身系統(tǒng)性骨質(zhì)疏松。同時,體外試驗證實氯化矢車菊素通過減緩IκB-α的降解、抑制ERK的磷酸化以及干擾RANKL介導的細胞內(nèi)鈣離子流動,從而抑制了RANKL信號傳導通路中NFATc1和c-Fos等轉錄因子的活化,最終抑制了破骨細胞的分化及功能。而且體外試驗結果顯示,氯化矢車菊素還能上調(diào)成骨細胞堿性磷酸酶的活性并促進其礦化能力。結論：氯化矢車菊素對卵巢切除導致的骨質(zhì)疏松有保護作用。其機制為,氯化矢車菊素抑制了RANKL介導的破骨細胞過度增殖及骨吸收作用；同時促進成骨細胞的分化及成骨作用。
[Abstract]:Bone remodeling is a dynamic process of bone degradation and synthetic metabolism and throughout the life of human beings . About 10 % of the bone is reported to undergo reconstruction and regeneration every year among adults ;
Osteoclasts derived from bone resorption and hematopoietic stem cells involved in bone synthesis . Osteoclasts are derived from hematopoietic stem cells in mononuclear phagocytes ( BMMs ) . Osteoclasts are a multinucleated giant cell with bone resorption . The proliferation , differentiation and maturation of cells are regulated by two key cytokines : macrophage colony stimulating factor ( M - CSF ) , nuclear factor - kappa B receptor activating factor ligand ( RANKL ) . M - CSF plays a decisive role in the differentiation and the function of bone resorption in vitro . In the bone microenvironment , RANKL and M - CSF , which play a key role in differentiation and maturation of osteoblasts , are mainly derived from osteoblasts .
In 1997 - 98 , RANKL was first cloned and synthesized and confirmed to be involved in regulating the differentiation and fusion and bone resorption function . The RANKL gene encodes two forms of protein form 鈪，

本文編號：2100827