本文選題：成骨細(xì)胞 + 誘導(dǎo)分化　； 參考：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：骨重建是一個骨質(zhì)分解及合成代謝的動態(tài)過程,并且貫穿人的一生。據(jù)報道,在成年人當(dāng)中每年約10%的骨骼經(jīng)歷重建和再生；承擔(dān)此任務(wù)的主要是兩類細(xì)胞：負(fù)責(zé)骨質(zhì)吸收的破骨細(xì)胞和參與骨質(zhì)合成的成骨細(xì)胞。破骨細(xì)胞來源于單核巨噬細(xì)胞系(BMMs)中的造血干細(xì)胞,成熟的破骨細(xì)胞是一種具有骨吸收功能的多核巨細(xì)胞。破骨細(xì)胞的增殖、分化及成熟受到兩個關(guān)鍵的細(xì)胞因子所調(diào)控：巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF),核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)。 M-CSF主要作用于單核巨噬細(xì)胞使其向破骨前體細(xì)胞分化增殖,并促進(jìn)破骨前體細(xì)胞特異性表達(dá)核因子-κB受體活化因子(RANK),同時還參與成熟破骨細(xì)胞的活化、黏附及遷徙。RANKL是一種Ⅱ型膜聯(lián)蛋白,屬于腫瘤壞死因子配體家族。在與其特異性受體RANK結(jié)合后,在M-CSF的協(xié)同作用下,RANKL對破骨細(xì)胞的進(jìn)一步分化及發(fā)揮骨吸收功能起決定性作用。成骨細(xì)胞來源于間充質(zhì)干細(xì)胞,分化成熟的成骨細(xì)胞能夠分泌膠原和糖蛋白,并產(chǎn)生細(xì)胞外骨基質(zhì)及礦化組織。同時在骨骼微環(huán)境內(nèi),成骨細(xì)胞在分化成熟過程中分泌大量細(xì)胞因子,從而影響破骨細(xì)胞的分化及功能。如上所述,對破骨細(xì)胞分化成熟起關(guān)鍵性作用的RANKL和M-CSF主要來源于成骨細(xì)胞；此外,成骨細(xì)胞還分泌Ⅰ型膠原及骨鈣素等化學(xué)趨化因子,調(diào)節(jié)破骨前體細(xì)胞的遷徙。在1997-1998年間,RANKL首次被克隆合成并證實其參與調(diào)節(jié)對破骨細(xì)胞的分化融合及骨吸收功能。RANKL基因編碼兩種不同功能的蛋白形式：兩種形式的Ⅱ型膜聯(lián)蛋白(RANKL1/2)和一種分泌性蛋白(RANKL3)。其中與破骨細(xì)胞表面特異性RANK受體結(jié)合的是RANKL1 。 RANKL在全身多個組織器官中都有較高的表達(dá),如乳腺、胸腺及肺臟等。在骨骼系統(tǒng)中,成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞為RANKL的主要來源。此外,RANKL的分泌還受到多種激素或細(xì)胞因子的影響：如甲狀旁腺激素、前列腺素E2、腫瘤壞死因子a、白介素-1/6/11、1-25-(2)羥基維生素D3等可以上調(diào)RANKL的分泌水平；而雌激素、雄性激素、轉(zhuǎn)移生長因子-p及干擾素-γ則對RANKL的分泌起抑制作用。目前大量文獻(xiàn)表明,RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞功能亢進(jìn)與各種類型的病理性骨溶解有著密切關(guān)系,例如：腫瘤導(dǎo)致的骨質(zhì)破壞、炎癥性的骨溶解、人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后無菌性假體松動、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、Paget's病、銀屑病性關(guān)節(jié)炎及強(qiáng)直性脊柱炎等等。因此,RANKL作為治療破骨細(xì)胞相關(guān)性骨溶解的一個理想靶點(diǎn),在臨床應(yīng)用上有著廣闊的前景。花色苷作為一種水溶性色素,是構(gòu)成植物王國中果實和花瓣顏色的主要成分之一；作為花青素的糖苷化形式,花色苷屬于黃酮類�；ㄇ嗨氐幕净瘜W(xué)結(jié)構(gòu)為2一苯基苯并吡喃,是一種陽離子�；ㄇ嗨厥且环N酚類化合物,其包括以下六個亞型：飛燕草色素、矢車菊素、牽牛花色素、天竺葵色素、芍藥色素和錦葵色素。此外,花青素可以直接口服并迅速進(jìn)入全身血液循環(huán),因此其具有很高的生物利用率。近年來,大量文獻(xiàn)報道花青素及花色苷具有抗腫瘤,抗炎癥反應(yīng)和抗氧化應(yīng)激等方面的活性。矢車菊素被認(rèn)為是花青素化合物在自然界中分布最廣的亞型,其主要分布于各種蔬菜、瓜果、豆類及紅酒之中；在歐美等國家成人平均每日攝入量在10mg以上,相關(guān)報道亦證實長期攝入矢車菊素具有降低癌癥、心血管疾病和糖尿病等發(fā)病率的作用。盡管國內(nèi)外大量研究已經(jīng)對矢車菊素的化學(xué)活性,治療相關(guān)疾病的臨床前期研究及其機(jī)制做了較為詳細(xì)的闡述；但是上述報道主要針對矢車菊素的糖苷形式(C3G:cyanidin-3-glycoside)。然而作為矢車菊素的氯化物單體形式,氯化矢車菊素(Cyanidin Chloride, CY)僅被報道具有保護(hù)水楊酸類藥物引起的胃腸粘膜損傷作用。到目前為止,關(guān)于氯化矢車菊素在溶骨性疾病的治療效果及其相關(guān)機(jī)制的研究未見報道。本實驗通過細(xì)胞生物學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),在體外環(huán)境中觀察氯化矢車菊素對破骨細(xì)胞的增殖、分化及骨吸收功能的影響；并在分子水平上探究其可能的影響機(jī)制。進(jìn)而,通過構(gòu)建卵巢切除所致的骨質(zhì)疏松小鼠動物模型,進(jìn)一步驗證氯化矢車菊素在體內(nèi)實驗中對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥等破骨細(xì)胞所致溶骨性疾病的療效。實驗內(nèi)容包括以下三個部分：第一部分骨髓單核巨噬細(xì)胞的分離和培養(yǎng),及向破骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化模型的建立和破骨細(xì)胞的生物學(xué)性狀分析目的：建立以小鼠骨髓單核細(xì)胞為來源的破骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)體系,通過形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及骨吸收功能等方面對破骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。方法：通過全骨髓細(xì)胞貼壁法分離提取骨髓單核細(xì)胞(BMMs)。之后在M-CSF和RANKL的刺激下,進(jìn)行骨髓造血細(xì)胞體外培養(yǎng)、擴(kuò)增,并誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞定向分化。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察,抗酒石酸酸性磷酸酶染色及骨吸收能力的檢測等方法對破骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定,以確定骨髓單核細(xì)胞體外分離培養(yǎng)體系向破骨細(xì)胞分化的能力及穩(wěn)定性。結(jié)果：在M-CSF作用下,骨髓細(xì)胞呈長梭形,以貼壁方式生長,增殖旺盛。加入RANKL刺激后,細(xì)胞逐步分化融合為空泡狀多核巨細(xì)胞,即成熟的破骨細(xì)胞。該多核巨細(xì)胞在抗酒石酸酸性磷酸酶染色時呈陽性反應(yīng)；并且具有骨吸收功能,能在皮質(zhì)骨板上形成骨吸收陷窩。結(jié)論：骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)及M-CSF/RANKL聯(lián)合刺激培養(yǎng)體系可以提供穩(wěn)定且充足的破骨細(xì)胞,對進(jìn)一步體外藥物干預(yù)實驗具有重要意義。第二部分 成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)模型的建立,及生物學(xué)性狀分析目的：小鼠原代成骨細(xì)胞的分離提取、培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察及功能鑒定。方法：取新鮮小鼠顱蓋骨,剪碎并碾磨后經(jīng)胰酶替代物消化；消化液離心,棄上清液后以含15%小牛血清的DMEM溶液培養(yǎng)于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板；待細(xì)胞鋪滿后加入誘導(dǎo)分化液。最后,對分化成熟的細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶活性及鈣結(jié)節(jié)檢測以鑒定其生物學(xué)特性。結(jié)果：成熟的成骨細(xì)胞為梭形,貼壁生長并能形成細(xì)胞突觸,生長旺盛。加入分化液,經(jīng)過7天誘導(dǎo)分化后能產(chǎn)生大量堿性磷酸酶,堿性磷酸酶染色陽性；經(jīng)過2周分化液培養(yǎng)后能在細(xì)胞培養(yǎng)板上形成礦化結(jié)節(jié),即鈣結(jié)節(jié)。結(jié)論：從小鼠顱骨分離提取原代成骨細(xì)胞,并用分化液在體外誘導(dǎo)分化成熟,是穩(wěn)定可靠的成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)體系。第二部分 成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)模型的建立,及生物學(xué)性狀分析目的：小鼠原代成骨細(xì)胞的分離提取、培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察及功能鑒定。方法：取新鮮小鼠顱蓋骨,剪碎并碾磨后經(jīng)胰酶替代物消化；消化液離心,棄上清液后以含15%小牛血清的DMEM溶液培養(yǎng)于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板；待細(xì)胞鋪滿后加入誘導(dǎo)分化液。最后,對分化成熟的細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶活性及鈣結(jié)節(jié)檢測以鑒定其生物學(xué)特性。結(jié)果：成熟的成骨細(xì)胞為梭形,貼壁生長并能形成細(xì)胞突觸,生長旺盛。加入分化液,經(jīng)過7天誘導(dǎo)分化后能產(chǎn)生大量堿性磷酸酶,堿性磷酸酶染色陽性；經(jīng)過2周分化液培養(yǎng)后能在細(xì)胞培養(yǎng)板上形成礦化結(jié)節(jié),即鈣結(jié)節(jié)。結(jié)論：從小鼠顱骨分離提取原代成骨細(xì)胞,并用分化液在體外誘導(dǎo)分化成熟,是穩(wěn)定可靠的成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)體系。第三部分 氯化矢車菊素對卵巢切除所致骨溶解的療效及其分子機(jī)制目的：觀察氯化矢車菊素對卵巢切除所致骨溶解及RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞過度生長的作用,并闡明其分子機(jī)制。方法：建立卵巢切除動物模型,通過Micro-CT及病理學(xué)檢查結(jié)果對骨骼形態(tài)學(xué)、破骨細(xì)胞的參數(shù)進(jìn)行比較分析,觀察氯化矢車菊素對卵巢切除所致骨溶解的療效。通過骨髓單核細(xì)胞體外分離培養(yǎng),TRAP染色及細(xì)胞計數(shù)、MTS細(xì)胞活力測定和流式細(xì)胞儀凋亡檢測、骨吸收實驗等,分別檢測氯化矢車菊素對破骨細(xì)胞的形成及骨吸收功能的影響,同時觀察其對破骨前體細(xì)胞的細(xì)胞毒性；進(jìn)而借助實時熒光定量RT-PCR檢測、Western-blot蛋白印跡測量、Luciferase螢光素酶報告基團(tuán)系統(tǒng)分析、鈣離子震蕩、酸化實驗等方法,探究氯化矢車菊素對破骨細(xì)胞分化及骨吸收功能的調(diào)控機(jī)制和所涉及的細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路。此外通過成骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)體系,觀察氯化矢車菊素對成骨細(xì)胞功能的影響。結(jié)果：氯化矢車菊素能有效地緩解卵巢切除所導(dǎo)致的小鼠全身系統(tǒng)性骨質(zhì)疏松。同時,體外試驗證實氯化矢車菊素通過減緩IκB-α的降解、抑制ERK的磷酸化以及干擾RANKL介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子流動,從而抑制了RANKL信號傳導(dǎo)通路中NFATc1和c-Fos等轉(zhuǎn)錄因子的活化,最終抑制了破骨細(xì)胞的分化及功能。而且體外試驗結(jié)果顯示,氯化矢車菊素還能上調(diào)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性并促進(jìn)其礦化能力。結(jié)論：氯化矢車菊素對卵巢切除導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松有保護(hù)作用。其機(jī)制為,氯化矢車菊素抑制了RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞過度增殖及骨吸收作用；同時促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化及成骨作用。
[Abstract]:Bone remodeling is a dynamic process of bone degradation and synthetic metabolism and throughout the life of human beings . About 10 % of the bone is reported to undergo reconstruction and regeneration every year among adults ;
Osteoclasts derived from bone resorption and hematopoietic stem cells involved in bone synthesis . Osteoclasts are derived from hematopoietic stem cells in mononuclear phagocytes ( BMMs ) . Osteoclasts are a multinucleated giant cell with bone resorption . The proliferation , differentiation and maturation of cells are regulated by two key cytokines : macrophage colony stimulating factor ( M - CSF ) , nuclear factor - kappa B receptor activating factor ligand ( RANKL ) . M - CSF plays a decisive role in the differentiation and the function of bone resorption in vitro . In the bone microenvironment , RANKL and M - CSF , which play a key role in differentiation and maturation of osteoblasts , are mainly derived from osteoblasts .
In 1997 - 98 , RANKL was first cloned and synthesized and confirmed to be involved in regulating the differentiation and fusion and bone resorption function . The RANKL gene encodes two forms of protein form 鈪，

本文編號：2100827