本文選題：破骨細胞 + 金黃色葡萄球菌A蛋白��； 參考：《第三軍醫(yī)大學》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景及目的:骨感染是骨折及骨科手術最常見而嚴重的并發(fā)癥之一,常常導致過度的骨質(zhì)破壞和骨不連,造成骨折不愈合或延遲愈合。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是造成骨感染的主要致病菌,約占創(chuàng)傷性骨髓炎檢出致病菌的65%~70%。金黃色葡萄球菌細菌壁廣泛存在著金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA),可以自由分泌到細胞外環(huán)境中,能廣泛結(jié)合宿主防御蛋白,改變宿主免疫反應。破骨細胞由造血干細胞系髓系單核細胞分化而來,是人體骨骼系統(tǒng)中唯一具有吸收和重塑骨骼形態(tài)的生理性多核巨細胞。它與成骨細胞是參與骨重建的主要細胞,二者共同調(diào)節(jié)骨組織代謝的動態(tài)平衡。在感染狀態(tài)下,急、慢性的炎癥刺激可以改變這種動態(tài)平衡,影響骨愈合。過往研究認為,金黃色葡萄球菌A蛋白可通過多種方式降低成骨細胞活性,抑制成骨過程,是導致骨不連的重要原因。另外,破骨細胞與過度的骨質(zhì)丟失現(xiàn)象密切相關,其分化過程受多種因素調(diào)節(jié)。然而,有關金黃色葡萄球菌A蛋白對破骨細胞形成影響及分子機制的研究鮮有報道。因此,課題組將通過:1.觀察慢性創(chuàng)傷性骨髓炎中金黃色葡萄球菌對骨量及破骨細胞的影響;2.觀察SPA對破骨細胞分化、融合及功能的影響;3.探索SPA影響破骨細胞的具體分子機制;為此類疾病的預防及治療找尋新的靶點。實驗方法:第一部分:臨床樣本觀察金葡菌感染對骨量及破骨細胞的影響1.收取臨床上明確診斷為慢性創(chuàng)傷性骨髓炎患者的病理樣本,術中取樣。2.以4%甲醛固定,10%EDTA脫鈣后,石蠟包埋,制作石蠟切片。3.以Masson、HE和TRAP染色觀察骨組織及破骨細胞情況。第二部分:體外實驗研究SPA對破骨細胞形成的影響1.以小鼠單核巨噬細胞系(RAW264.7)體外培養(yǎng),在RANKL和M-CSF的作用下建立破骨細胞誘導模型。2.以不同濃度梯度的SPA與細胞培養(yǎng),以CCK8實驗檢測其對細胞增殖毒性的影響,確定實驗的安全濃度。3.按照實驗設置的分組,將不同濃度梯度的SPA與細胞培養(yǎng),設置對照,誘導三天后以抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒染色,觀察破骨細胞形成的數(shù)量;4.以黏著斑(FAK)染色觀察破骨細胞的形態(tài)及融合情況;5.以骨吸收陷窩實驗觀察SPA對破骨細胞骨吸收功能的影響;6.細胞流式技術檢測SPA對細胞早期和晚期凋亡的影響;第三部分:SPA促進破骨細胞形成的機制研究1.以RT-PCR技術檢測破骨細胞形成相關的m RNA表達量變化;2.Westernblot技術檢測NFATC1、c-FOS及其上游MAPK通路相關蛋白的表達量變化。3.阻斷MAPK通路,Western blot技術檢測NFATC1、c-FOS表達量變化。實驗結(jié)果:一、金黃色葡萄球菌所致慢性創(chuàng)傷性骨髓炎患者的感染部位的骨小梁較非感染組明顯變薄,破骨細胞處于明顯激活狀態(tài)。二、SPA促進了破骨細胞分化、融合,增強了其骨吸收功能。1.RAW264.7細胞在50ng/ml的RANKL和50ng/ml的M-CSF作用下誘導三天,我們建立了穩(wěn)定的破骨細胞體外誘導培養(yǎng)體系。2.本研究首先以不同濃度梯度的SPA與RAW264.7細胞共同培養(yǎng),CCK8實驗結(jié)果顯示SPA濃度在1000μg/ml時吸光度值顯著下降。流式分析的結(jié)果顯示SPA對細胞的早期及晚期凋亡均無影響。3.根據(jù)CCK8實驗結(jié)果,將各個實驗分組的SPA濃度設置在安全范圍之內(nèi),即0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml。TRAP染色結(jié)果顯示破骨細胞(細胞核3核)的細胞數(shù)量較對照組明顯增多。4.FAK染色結(jié)果顯示實驗組較對照組破骨細胞的數(shù)量及平均核數(shù)均明顯增加。5.骨吸收陷窩實驗結(jié)果顯示各實驗組的骨吸收陷窩較對照組明顯增加。三、qPCR結(jié)果顯示實驗組CTSK、TRAP、CTR、DC-STAMP等破骨細胞形成相關基因表達明顯上調(diào)。Western blot檢測NFATC1、c-FOS等轉(zhuǎn)錄因子的表達明顯上調(diào)。MAPK通路的ERK、JNK、P38的磷酸化水平即p-ERK、p-JNK、p-P38的表達量均明顯增加。同時,上述通路被阻斷后NFATC1、c-FOS的表達水平降低。結(jié)論:金黃色葡萄球菌導致的骨感染中骨丟失加劇、破骨細胞處于過度激活狀態(tài)。金黃色葡萄球菌A蛋白作為主要抗原成分,它能夠促進破骨細胞分化、融合,促使骨吸收功能增加。SPA通過激活MAPK通路促使其下游NFATc1、c-FOS表達上調(diào),促使破骨細胞形成。我們的研究結(jié)果有助于更好的理解金黃色葡萄球菌在骨感染中的致病作用,對于治療此類疾病具有重要的意義。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of SPA on bone mass and fracture of bone tissue . The results showed that the expression of NF ATC1 , c - FOS increased significantly in the experimental group . The results showed that the expression of NF ATC1 , c - FOS increased significantly in the experimental group .
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R68

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本文編號：1976768