本文選題：破骨細(xì)胞 + 金黃色葡萄球菌A蛋白�。� 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景及目的:骨感染是骨折及骨科手術(shù)最常見(jiàn)而嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,常常導(dǎo)致過(guò)度的骨質(zhì)破壞和骨不連,造成骨折不愈合或延遲愈合。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是造成骨感染的主要致病菌,約占創(chuàng)傷性骨髓炎檢出致病菌的65%~70%。金黃色葡萄球菌細(xì)菌壁廣泛存在著金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA),可以自由分泌到細(xì)胞外環(huán)境中,能廣泛結(jié)合宿主防御蛋白,改變宿主免疫反應(yīng)。破骨細(xì)胞由造血干細(xì)胞系髓系單核細(xì)胞分化而來(lái),是人體骨骼系統(tǒng)中唯一具有吸收和重塑骨骼形態(tài)的生理性多核巨細(xì)胞。它與成骨細(xì)胞是參與骨重建的主要細(xì)胞,二者共同調(diào)節(jié)骨組織代謝的動(dòng)態(tài)平衡。在感染狀態(tài)下,急、慢性的炎癥刺激可以改變這種動(dòng)態(tài)平衡,影響骨愈合。過(guò)往研究認(rèn)為,金黃色葡萄球菌A蛋白可通過(guò)多種方式降低成骨細(xì)胞活性,抑制成骨過(guò)程,是導(dǎo)致骨不連的重要原因。另外,破骨細(xì)胞與過(guò)度的骨質(zhì)丟失現(xiàn)象密切相關(guān),其分化過(guò)程受多種因素調(diào)節(jié)。然而,有關(guān)金黃色葡萄球菌A蛋白對(duì)破骨細(xì)胞形成影響及分子機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。因此,課題組將通過(guò):1.觀察慢性創(chuàng)傷性骨髓炎中金黃色葡萄球菌對(duì)骨量及破骨細(xì)胞的影響;2.觀察SPA對(duì)破骨細(xì)胞分化、融合及功能的影響;3.探索SPA影響破骨細(xì)胞的具體分子機(jī)制;為此類疾病的預(yù)防及治療找尋新的靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)方法:第一部分:臨床樣本觀察金葡菌感染對(duì)骨量及破骨細(xì)胞的影響1.收取臨床上明確診斷為慢性創(chuàng)傷性骨髓炎患者的病理樣本,術(shù)中取樣。2.以4%甲醛固定,10%EDTA脫鈣后,石蠟包埋,制作石蠟切片。3.以Masson、HE和TRAP染色觀察骨組織及破骨細(xì)胞情況。第二部分:體外實(shí)驗(yàn)研究SPA對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響1.以小鼠單核巨噬細(xì)胞系(RAW264.7)體外培養(yǎng),在RANKL和M-CSF的作用下建立破骨細(xì)胞誘導(dǎo)模型。2.以不同濃度梯度的SPA與細(xì)胞培養(yǎng),以CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖毒性的影響,確定實(shí)驗(yàn)的安全濃度。3.按照實(shí)驗(yàn)設(shè)置的分組,將不同濃度梯度的SPA與細(xì)胞培養(yǎng),設(shè)置對(duì)照,誘導(dǎo)三天后以抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒染色,觀察破骨細(xì)胞形成的數(shù)量;4.以黏著斑(FAK)染色觀察破骨細(xì)胞的形態(tài)及融合情況;5.以骨吸收陷窩實(shí)驗(yàn)觀察SPA對(duì)破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響;6.細(xì)胞流式技術(shù)檢測(cè)SPA對(duì)細(xì)胞早期和晚期凋亡的影響;第三部分:SPA促進(jìn)破骨細(xì)胞形成的機(jī)制研究1.以RT-PCR技術(shù)檢測(cè)破骨細(xì)胞形成相關(guān)的m RNA表達(dá)量變化;2.Westernblot技術(shù)檢測(cè)NFATC1、c-FOS及其上游MAPK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量變化。3.阻斷MAPK通路,Western blot技術(shù)檢測(cè)NFATC1、c-FOS表達(dá)量變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:一、金黃色葡萄球菌所致慢性創(chuàng)傷性骨髓炎患者的感染部位的骨小梁較非感染組明顯變薄,破骨細(xì)胞處于明顯激活狀態(tài)。二、SPA促進(jìn)了破骨細(xì)胞分化、融合,增強(qiáng)了其骨吸收功能。1.RAW264.7細(xì)胞在50ng/ml的RANKL和50ng/ml的M-CSF作用下誘導(dǎo)三天,我們建立了穩(wěn)定的破骨細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系。2.本研究首先以不同濃度梯度的SPA與RAW264.7細(xì)胞共同培養(yǎng),CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SPA濃度在1000μg/ml時(shí)吸光度值顯著下降。流式分析的結(jié)果顯示SPA對(duì)細(xì)胞的早期及晚期凋亡均無(wú)影響。3.根據(jù)CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將各個(gè)實(shí)驗(yàn)分組的SPA濃度設(shè)置在安全范圍之內(nèi),即0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml。TRAP染色結(jié)果顯示破骨細(xì)胞(細(xì)胞核3核)的細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯增多。4.FAK染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組破骨細(xì)胞的數(shù)量及平均核數(shù)均明顯增加。5.骨吸收陷窩實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組的骨吸收陷窩較對(duì)照組明顯增加。三、qPCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組CTSK、TRAP、CTR、DC-STAMP等破骨細(xì)胞形成相關(guān)基因表達(dá)明顯上調(diào)。Western blot檢測(cè)NFATC1、c-FOS等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)明顯上調(diào)。MAPK通路的ERK、JNK、P38的磷酸化水平即p-ERK、p-JNK、p-P38的表達(dá)量均明顯增加。同時(shí),上述通路被阻斷后NFATC1、c-FOS的表達(dá)水平降低。結(jié)論:金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的骨感染中骨丟失加劇、破骨細(xì)胞處于過(guò)度激活狀態(tài)。金黃色葡萄球菌A蛋白作為主要抗原成分,它能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、融合,促使骨吸收功能增加。SPA通過(guò)激活MAPK通路促使其下游NFATc1、c-FOS表達(dá)上調(diào),促使破骨細(xì)胞形成。我們的研究結(jié)果有助于更好的理解金黃色葡萄球菌在骨感染中的致病作用,對(duì)于治療此類疾病具有重要的意義。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of SPA on bone mass and fracture of bone tissue . The results showed that the expression of NF ATC1 , c - FOS increased significantly in the experimental group . The results showed that the expression of NF ATC1 , c - FOS increased significantly in the experimental group .
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R68

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本文編號(hào)：1976768