本文選題：脂多糖 + Toll樣受體4　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:分析脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)信號(hào)通路對(duì)BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化的影響,并探討其可能的影響機(jī)制。方法:首先通過RT-PCR和Western blot檢測(cè)MSCs中TLR4的內(nèi)源性表達(dá);再用Ad-GFP和Ad-BMP9感染MSCs后通過Western blot檢測(cè)TLR4表達(dá)變化,通過RT-PCR檢測(cè)TLR4下游靶基因IL-1β和IL-6表達(dá)變化;之后在Ad-GFP和Ad-BMP9感染的MSCs中加入LPS,分別檢測(cè)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、鈣鹽沉積、晚期成骨標(biāo)志基因骨橋蛋白(osteopontin,OPN)的表達(dá)變化、Smad1/5/8信號(hào)通路激活情況和成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)的表達(dá)變化;隨后在N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)預(yù)處理MSCs后,加入LPS,通過DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)變化,通過Western blot檢測(cè)抗氧化相關(guān)因子Nrf2、SOD1和SOD2的表達(dá)變化;然后在BAY11-7082預(yù)處理MSCs后加入LPS,用DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS變化;最后用BAY11-7082和NAC預(yù)處理Ad-GFP和Ad-BMP9感染的MSCs,再加入LPS,分別檢測(cè)ALP、鈣鹽沉積、OPN的表達(dá)變化、Smad1/5/8信號(hào)通路激活情況和Runx2的表達(dá)變化。結(jié)果:TLR4在3種MSCs中均有表達(dá);外源性過表達(dá)BMP9可以抑制TLR4的表達(dá),但不影響IL-1β和IL-6表達(dá);LPS激活TLR4信號(hào)通路抑制BMP9誘導(dǎo)的ALP活性、鈣鹽沉積、OPN表達(dá)、Smad1/5/8信號(hào)通路的激活和Runx2的表達(dá);LPS激活TLR4信號(hào)通路增加MSCs中ROS;BAY11-7082可以阻斷LPS激活TLR4信號(hào)通路導(dǎo)致的MSCs中ROS增加;BAY11-7082和NAC均可以部分逆轉(zhuǎn)LPS激活TLR4信號(hào)通路后對(duì)BMP9誘導(dǎo)的ALP活性、鈣鹽沉積、OPN表達(dá)、Smad1/5/8信號(hào)通路的激活和Runx2的表達(dá)的抑制。結(jié)論:LPS激活TLR4可以通過NF-κB/ROS抑制BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化。
[Abstract]:Aim: to investigate the effect of lipopolysaccharide (LPS) activation of Toll like receptor 4(Toll-like receptor 4 (TLR4) signaling pathway on mesenchymal stem cells differentiation induced by BMP9, and to explore its possible mechanism. Methods: the endogenous expression of TLR4 in MSCs was detected by RT-PCR and Western blot, then by Western blot after MSCs infection with Ad-GFP and Ad-BMP9, IL-1 尾 and IL-6 were detected by RT-PCR, and IL-1 尾 and IL-6 were detected by RT-PCR. After adding LPSs to MSCs infected with Ad-GFP and Ad-BMP9, alkaline phosphatase (ALP), alkaline phosphatase (ALP) and calcium deposition were detected, respectively. Expression of osteopontin (osteopontinine), a late osteopontin marker gene, the activation of Smad1 / 5 / 8 signaling pathway and the expression of 2(runt-related transcription factor 2 / Runx2, a transcription factor associated with osteogenic key transcription factor (runt), followed by pretreatment of MSCs with N-acetyl-L-cysteine NAC- (N-acetyl-L-cysteine). The changes of reactive oxygen speciess-ROS in cells were detected by DCFH-DA, the expression of Nrf2SOD1 and SOD2 were detected by Western blot, and the changes of ROS were detected by DCFH-DA after BAY11-7082 pretreatment with MSCs. Finally, Ad-GFP and Ad-BMP9 infected MSCs were pretreated with BAY11-7082 and NAC, and then LPSs were added to detect the expression of ALP, Ca ~ (2 +) ~ (2 +) and OPN. The activation of Smad1 / 5 / 8 signaling pathway and the expression of Runx2 were detected. Results: TLR4 was expressed in all three kinds of MSCs, exogenous overexpression of BMP9 could inhibit the expression of TLR4, but it did not affect the expression of IL-1 尾 and IL-6. LPS-activated TLR4 signal pathway inhibited ALP activity induced by BMP9. Activation of Smad1 / 5 / 8 signaling pathway and Runx2 expression LPS-activated TLR4 signaling pathway increased ROSBAY11-7082 in MSCs by blocking ROS increase in MSCs induced by LPS activation of TLR4 signaling pathway and partial reversal of LPS activated TLR4 signaling pathway induced by LPS activation of TLR4 signaling pathway ALP activity induced by BMP9, The activation of Smad1 / 5 / 8 signaling pathway and the inhibition of Runx2 expression. Conclusion TLR4 activated by TLR4 can inhibit the osteogenic differentiation of MSCs induced by BMP9 through NF- 魏 B/ROS.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R68

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本文編號(hào)：1972444