本文選題：內(nèi)皮祖細(xì)胞 + 成血管功能��； 參考：《蘇州大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目的 分離、培養(yǎng)、鑒定晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)。將晚期EPCs,作為種子細(xì)胞,研究晚期EPCs的生物學(xué)特性。制作小腸粘膜下層組織(small intestinal submucosa,SIS),并作為細(xì)胞外基質(zhì)材料,研究與晚期EPCs在體外共培養(yǎng)的生物相容性,以及EPCs在SIS表面的生長(zhǎng)情況。觀察復(fù)合晚期EPCs的SIS構(gòu)建的小口徑人工血管的性能,以及修復(fù)兔頸動(dòng)脈缺損的實(shí)驗(yàn)研究。方法 骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離后以EGM-2MV培養(yǎng),采用免疫組化、免疫熒光和流式細(xì)胞儀鑒定晚期EPCs相關(guān)標(biāo)志CD34、CDl33、VEGFR-2和v WF的表達(dá);Dil-ac LDL和FITC-UEA-1的攝取能力,MTT法繪制晚期EPCs生長(zhǎng)曲線;Matigel膠測(cè)定晚期EPCs成血管功能;透射電鏡觀察晚期EPCs向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的特征。SIS來(lái)自于豬的小腸,經(jīng)過(guò)物理和化學(xué)的處理制備得到。用光學(xué)顯微鏡觀察晚期EPCs在SIS上的生長(zhǎng)形態(tài),增殖率通過(guò)MTT測(cè)定。通過(guò)ELISA和免疫印跡法,測(cè)定晚期EPCs接種到SIS后生產(chǎn)血管生成素-1(ANG-1)和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的含量。將SIS膜以膠原蛋白和硫酸軟骨素混合液粘接,并縫合制作SIS管。體外測(cè)試支架爆破壓,溶血試驗(yàn),對(duì)凝血時(shí)間的影響。接種晚期EPCs,并掃描電鏡觀察接種情況。移植入兔頸動(dòng)脈缺損處,定期行彩超和DSA檢查觀察移植血管的情況。行組織學(xué)檢查觀察移植入的SIS管重塑情況,掃描電鏡和熒光顯微鏡觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞層情況。結(jié)果 早期EPCs呈集落樣生長(zhǎng),晚期EPCs表現(xiàn)出鵝卵石形態(tài),紡錘狀的形狀。晚期EPCs表面抗原標(biāo)志物CD34,CD133,VEGFR-2,v WF表達(dá)為不同程度的陽(yáng)性;流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示早期EPCs的CD133含量較高,后逐漸降低;晚期EPCs的VEGFR-2含量上升。晚期EPCs增殖明顯,形成網(wǎng)狀連接的管腔樣結(jié)構(gòu)。電鏡下晚期EPCs可見(jiàn)到內(nèi)皮細(xì)胞特征性細(xì)胞器-Weible-Palade(W-P)小體。光鏡顯示,機(jī)械和化學(xué)處理的小腸粘膜下層是由細(xì)胞外基質(zhì)組成。晚期EPCs和SIS共同培養(yǎng)后,細(xì)胞增殖率明顯提高,并能夠在SIS上粘附,生長(zhǎng)和增殖。共同培養(yǎng)后,ANG-1的分泌量在第1d時(shí)就較單純的晚期EPCs組升高,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,到第7d時(shí)分泌量達(dá)到最高,后逐漸下降。VEGF的分泌量呈隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高后,一直穩(wěn)定在較高的水平。免疫印跡分析進(jìn)一步表明,晚期EPCs播種到SIS的表面上ANG-1和VEGF均有明顯的升高。制作的SIS管有良好的爆破壓,能夠延長(zhǎng)凝血時(shí)間,符合醫(yī)用材料的溶血率試驗(yàn)要求,不會(huì)對(duì)血細(xì)胞造成破壞。接種的細(xì)胞能夠在SIS管上生長(zhǎng)。復(fù)合晚期EPCs的SIS管在8w時(shí)有50%的通暢率。組織學(xué)顯示,SIS已經(jīng)有很好的重塑反應(yīng),可見(jiàn)膠原纖維和平滑肌細(xì)胞。掃描電鏡可見(jiàn)完整的內(nèi)皮細(xì)胞層,部分內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源于標(biāo)記的晚期EPCs。結(jié)論 骨髓中存在不同特質(zhì)的早期EPCs和晚期EPCs,晚期EPCs增殖強(qiáng),具有成血管能力,能夠轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細(xì)胞,有限的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,晚期EPCs可能是一個(gè)有吸引力的誘導(dǎo)血管新生的候選細(xì)胞。SIS與晚期EPCs有良好的生物相容性,能夠很好的促進(jìn)晚期EPCs的生長(zhǎng)。制作的SIS管能夠符合移植血管的要求,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中能夠很好的和宿主整合,并形成完整的內(nèi)皮細(xì)胞層。
[Abstract]:Objective to isolate, culture and identify advanced endothelial progenitor cells (Endothelial progenitor cells, EPCs). Advanced EPCs was used as seed cells to study the biological characteristics of late EPCs, and to make small intestinal submucosa (small intestinal submucosa, SIS) as extracellular matrix material and to study the biocompatibility of later EPCs in vitro. Sex, and the growth of EPCs on the surface of SIS. Observe the performance of the small caliber artificial blood vessels constructed by SIS combined with late EPCs and the experimental study of the repair of rabbit carotid artery defect. Method bone marrow mononuclear cells were isolated and cultured with EGM-2MV. Immunohistochemistry, immunofluorescence and flow cytometry were used to identify the late EPCs related markers CD34, CDl33, V. The expression of EGFR-2 and V WF; the uptake of Dil-ac LDL and FITC-UEA-1, MTT method to draw late EPCs growth curve; Matigel glue for the determination of late EPCs into vascular function; transmission electron microscopy to observe the characteristics of late EPCs to endothelial cells from the pig's small intestine and prepared by physical and chemical treatment. The growth morphology and proliferation rate of s on SIS were measured by MTT. The content of angiopoietin -1 (ANG-1) and endothelial growth factor (VEGF) was measured by ELISA and Western blot. The SIS membrane was bonded with collagen and chondroitin sulfate, and the SIS tube was sutured. The stent was tested by blasting pressure and hemolysis in vitro. The effect of the test on the time of coagulation. Inoculation of late EPCs and scanning electron microscope. The condition of transplantation into rabbit carotid artery defect was observed by color Doppler ultrasound and DSA examination. The remolding of the transplanted SIS tube was observed by histological examination. The vascular endothelial cell layer was observed by scanning electron microscope and fluorescence microscope. The results were early and the results were early. EPCs showed cobblestone morphology and spindle shape. Late EPCs surface antigen markers CD34, CD133, VEGFR-2, V WF were expressed as positive in different degrees. Flow cytometry showed that the CD133 content of early EPCs was higher, then decreased gradually, and EPCs VEGFR-2 content increased in the late stage. In the late EPCs, the endothelial cell characteristic organelle -Weible-Palade (W-P) corpuscle can be seen under the electron microscope. The light mirror shows that the subcellular matrix of the small intestinal mucosa is composed of mechanical and chemical treatment of the small intestinal mucosa. After the co culture of late EPCs and SIS, the cell proliferation rate is obviously increased, and it can adhere to SIS, grow and increase. After co culture, the secretion of ANG-1 was increased at 1D than in the simple late EPCs group. As the time extended, the secretory amount reached the highest at 7d, and then the secretion of.VEGF gradually decreased with the increase of time and remained stable at a higher level. Western blot analysis further indicated that late EPCs was further indicated by the Western blot analysis. The ANG-1 and VEGF on the surface of the sowing to SIS have an obvious increase. The produced SIS tube has good blasting pressure, can prolong the blood coagulation time, meet the requirement of the hemolytic test of medical materials, not cause damage to the blood cells. The cells inoculated can grow on the SIS tube. The SIS tube of the compound late EPCs has 50% patency rate when 8W. Histology shows SIS has a good remodeling response, visible collagen fiber and smooth muscle cells. Scanning electron microscopy shows a complete endothelial cell layer. Part of the endothelial cells originate from the labeled late EPCs. conclusion that there are early EPCs and late EPCs in the bone marrow of the bone marrow, and the advanced EPCs is strong, and has the ability of angiogenesis and can be transformed into endothelial cells. The limited experimental results show that late EPCs may be an attractive candidate cell for inducing angiogenesis,.SIS has good biocompatibility with late EPCs, and can promote the growth of advanced EPCs. The SIS tube can conform to the requirements of the transplanted blood vessel, and it can be well integrated with the host in the body and form the whole in the body. The endothelial cell layer.
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R654.3

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本文編號(hào)：1954269