本文選題：脊髓損傷 + TNF-α��； 參考：《成都醫(yī)學(xué)院》2015年碩士論文

【摘要】：目的觀察大鼠脊髓鈍挫后氧化損傷的程度,研究腫瘤壞死因α(TNF-α)和過氧化物氧化還原酶6(Prdx6)在基因水平和蛋白水平上的表達(dá)變化,及其對(duì)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響,探討炎癥損傷和氧化損傷對(duì)脊髓二次損傷和脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響。方法本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)將153只SD大鼠分成脊髓損傷組和假手術(shù)組。采用改良的Allen’s方法在T9脊髓節(jié)段制備脊髓損傷模型;假手術(shù)組動(dòng)物只打開椎板,不傷脊髓;建模后用BBB方法評(píng)價(jià)脊髓損傷的功能恢復(fù)情況。采用脊髓組織芯片制備技術(shù)制作脊髓組織切片,將假手術(shù)組和損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的組織放置在同一張切片中進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色觀察。利用MDA和SOD試劑盒分別測(cè)定損傷后2h,6h,12h,1d,3d,5d及7d大鼠血清內(nèi)自由基含量和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)的活性。采用酶免疫組織化學(xué)技術(shù)和免疫熒光技術(shù)確定TNF-α和Prdx6在細(xì)胞內(nèi)的定位表達(dá)。采用Q-PCR的方法探究在SCI后TNF-α和Prdx6基因水平的表達(dá)變化;采用WB免疫蛋白印跡研究SCI后TNF-α和Prdx6蛋白的表達(dá)變化。應(yīng)用生物信息學(xué)方法探索TNF-α和Prdx6基因之間是否具有聯(lián)系。運(yùn)用SPSS Statistics17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,采用單因素方差分析來比較均值,以P0.05作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果(1)BBB評(píng)分結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)用改良的Allen’s方法成功建立大鼠脊髓鈍挫傷型脊髓損傷模型。BBB評(píng)分結(jié)果顯示,在脊髓鈍挫傷后,模型組大鼠產(chǎn)生明顯的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能障礙,術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn),模型組大鼠BBB評(píng)分顯著低于假手術(shù)組(P0.05)。在術(shù)后1d和3d,大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能明顯障礙,仍處于完全癱瘓的狀態(tài)。隨著時(shí)間的推移,我們觀察到模型組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能在損傷后的7d開始恢復(fù),14d時(shí)BBB評(píng)分顯著升高(與術(shù)后1d相比,有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05),提示脊髓鈍挫傷后損傷脊髓仍具有一定的可塑性。(2)HE染色病理結(jié)果:假手術(shù)組脊髓組織完整,細(xì)胞形態(tài)正常,胞核和胞質(zhì)染色清晰。損傷后的脊髓組織在脊髓背側(cè)金屬棒打擊部位出現(xiàn)組織壞死,損傷早期,脊髓組織呈現(xiàn)出血、水腫、結(jié)構(gòu)紊亂等一系列病理學(xué)變化。損傷后3d,脊髓灰質(zhì)前角神經(jīng)元發(fā)生腫脹、核固縮;損傷后7d,大量的炎性細(xì)胞開始浸潤(rùn),持續(xù)至28d后開始消退。(3)脊髓損傷后,MDA在損傷后立即上升,在損傷后5d達(dá)高峰;而SOD的活性在SCI后持續(xù)下降,至傷后2h最低,隨后稍有上升,但至傷后7d仍明顯低于假手術(shù)組水平(P0.05)。(4)免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)果顯示:TNF-α在脊髓神經(jīng)細(xì)胞的胞核與胞漿內(nèi)均有表達(dá),在神經(jīng)元主要以胞質(zhì)表達(dá)為主,在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞主要以細(xì)胞核為主。在正常脊髓組織中,TNF-α微量表達(dá);SCI后,在脊髓灰質(zhì)中,TNF-α主要分布于前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的胞質(zhì)中,少量表達(dá)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)和胞核內(nèi);而在白質(zhì),TNF-α則大量表達(dá)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核內(nèi)及神經(jīng)纖維中。Prdx6在正常脊髓組織的灰質(zhì)前角的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞核和胞質(zhì)內(nèi)均有明顯表達(dá),在神經(jīng)元中表達(dá)較少;免疫熒光發(fā)現(xiàn),TNF-α和Prdx6都在脊髓灰質(zhì)前角的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中都表達(dá)。SCI后6h,Prdx6的表達(dá)明顯減少;至損傷后5d,Prdx6在脊髓前角的表達(dá)增加,繼而在7d時(shí)下降,在這個(gè)過程中,Prdx6的表達(dá)量始終是低于假手術(shù)組水平的。(5)Q-PCR結(jié)果顯示:與假手術(shù)組相比,TNF-α的基因水平在SCI后6h、1d和14d呈顯著性上升(P0.05)。然而,在SCI后,Prdx6的m RNA水平卻呈現(xiàn)持續(xù)性的下降。(6)WB結(jié)果顯示:與假手術(shù)組相比,TNF-α蛋白表達(dá)在脊髓損傷后12h時(shí)明顯上升(P0.05),此后,1d,3d和7d與假手術(shù)組相比仍然升高。與假手術(shù)組相比,Prdx6蛋白表達(dá)在脊髓損傷后呈現(xiàn)持續(xù)性下降(P0.05)。(7)生物信息學(xué)方法提示TNF-α和Prdx6基因之間通過活性轉(zhuǎn)錄因子3(Activating Transcription Factor,ATF3)和活性轉(zhuǎn)錄因子4(Activating Transcription Factor4,ATF4)產(chǎn)生間接的聯(lián)系。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)首次觀察到,在脊髓損傷后,過氧化物氧化還原酶6(Prdx6)基因和蛋白降低,Prdx6在脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)用生物信息學(xué)方法觀察到TNF-α和Prdx6之間具有相互聯(lián)系,TNF-α和Prdx6共同參與了脊髓損傷后的病理過程,與急性脊髓損傷的發(fā)生發(fā)展有關(guān),對(duì)脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)觀察到在脊髓損傷后,丙二醛MDA和炎癥因子TNF-α在脊髓損傷后立即上升,提示炎癥反應(yīng)和氧化損傷共同存在,相互作用,是促進(jìn)脊髓二次損傷的重要因素。TNF-α的基因水平在SCI后6h上升至峰值,其蛋白水平在SCI后12h達(dá)到最高水平,而此時(shí)脊髓運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分最低,幾乎為0;在SCI后7d時(shí),TNF-α的基因水平和蛋白水平均有所降低,此時(shí),BBB評(píng)分較之前升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示TNF-α是影響脊髓運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的因素。因此,TNF-α具有促進(jìn)脊髓早期炎癥反應(yīng)和抑制脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作用,Prdx6具有抗氧化反應(yīng)和促進(jìn)脊髓運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)的作用,他們可以作為脊髓損傷的治療靶點(diǎn),為臨床脊髓損傷治療提供新的選擇。
[Abstract]:Objective To investigate the expression of TNF - 偽 and Prx 6 in spinal cord injury in rats after spinal cord injury , and to investigate the effect of inflammatory injury and oxidative damage on spinal cord injury after spinal cord injury . ( 2 ) The pathological results of HE staining showed that the spinal cord tissue was intact in the sham operation group , the cell morphology was normal , the nucleus and the cytoplasm were stained clearly . ( 5 ) The results of Q - PCR showed that the mRNA level of TNF - 偽 increased significantly at 6h , 1d and 14d after SCI ( P0.05 ) . (7)鐢熺墿淇℃伅瀛︽柟娉曟彁紺篢NF-偽鍜孭rdx6鍩哄洜涔嬮棿閫氳繃媧繪，

本文編號(hào)：1925887