本文選題：脊髓損傷 + TNF-α　； 參考：《成都醫(yī)學院》2015年碩士論文

【摘要】：目的觀察大鼠脊髓鈍挫后氧化損傷的程度,研究腫瘤壞死因α(TNF-α)和過氧化物氧化還原酶6(Prdx6)在基因水平和蛋白水平上的表達變化,及其對脊髓損傷后運動功能恢復的影響,探討炎癥損傷和氧化損傷對脊髓二次損傷和脊髓損傷后運動功能恢復的影響。方法本實驗隨機將153只SD大鼠分成脊髓損傷組和假手術組。采用改良的Allen’s方法在T9脊髓節(jié)段制備脊髓損傷模型;假手術組動物只打開椎板,不傷脊髓;建模后用BBB方法評價脊髓損傷的功能恢復情況。采用脊髓組織芯片制備技術制作脊髓組織切片,將假手術組和損傷后不同時間點的組織放置在同一張切片中進行HE染色和免疫組織化學染色觀察。利用MDA和SOD試劑盒分別測定損傷后2h,6h,12h,1d,3d,5d及7d大鼠血清內(nèi)自由基含量和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)的活性。采用酶免疫組織化學技術和免疫熒光技術確定TNF-α和Prdx6在細胞內(nèi)的定位表達。采用Q-PCR的方法探究在SCI后TNF-α和Prdx6基因水平的表達變化;采用WB免疫蛋白印跡研究SCI后TNF-α和Prdx6蛋白的表達變化。應用生物信息學方法探索TNF-α和Prdx6基因之間是否具有聯(lián)系。運用SPSS Statistics17.0統(tǒng)計學軟件進行分析,采用單因素方差分析來比較均值,以P0.05作為檢驗標準。結果(1)BBB評分結果:本實驗用改良的Allen’s方法成功建立大鼠脊髓鈍挫傷型脊髓損傷模型。BBB評分結果顯示,在脊髓鈍挫傷后,模型組大鼠產(chǎn)生明顯的運動神經(jīng)功能障礙,術后各個時間點,模型組大鼠BBB評分顯著低于假手術組(P0.05)。在術后1d和3d,大鼠后肢運動功能明顯障礙,仍處于完全癱瘓的狀態(tài)。隨著時間的推移,我們觀察到模型組大鼠后肢運動功能在損傷后的7d開始恢復,14d時BBB評分顯著升高(與術后1d相比,有明顯統(tǒng)計學意義,P0.05),提示脊髓鈍挫傷后損傷脊髓仍具有一定的可塑性。(2)HE染色病理結果:假手術組脊髓組織完整,細胞形態(tài)正常,胞核和胞質染色清晰。損傷后的脊髓組織在脊髓背側金屬棒打擊部位出現(xiàn)組織壞死,損傷早期,脊髓組織呈現(xiàn)出血、水腫、結構紊亂等一系列病理學變化。損傷后3d,脊髓灰質前角神經(jīng)元發(fā)生腫脹、核固縮;損傷后7d,大量的炎性細胞開始浸潤,持續(xù)至28d后開始消退。(3)脊髓損傷后,MDA在損傷后立即上升,在損傷后5d達高峰;而SOD的活性在SCI后持續(xù)下降,至傷后2h最低,隨后稍有上升,但至傷后7d仍明顯低于假手術組水平(P0.05)。(4)免疫組織化學技術結果顯示:TNF-α在脊髓神經(jīng)細胞的胞核與胞漿內(nèi)均有表達,在神經(jīng)元主要以胞質表達為主,在神經(jīng)膠質細胞主要以細胞核為主。在正常脊髓組織中,TNF-α微量表達;SCI后,在脊髓灰質中,TNF-α主要分布于前角運動神經(jīng)元的胞質中,少量表達于神經(jīng)膠質細胞胞質和胞核內(nèi);而在白質,TNF-α則大量表達于神經(jīng)膠質細胞的胞質和胞核內(nèi)及神經(jīng)纖維中。Prdx6在正常脊髓組織的灰質前角的神經(jīng)膠質細胞的胞核和胞質內(nèi)均有明顯表達,在神經(jīng)元中表達較少;免疫熒光發(fā)現(xiàn),TNF-α和Prdx6都在脊髓灰質前角的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞中都表達。SCI后6h,Prdx6的表達明顯減少;至損傷后5d,Prdx6在脊髓前角的表達增加,繼而在7d時下降,在這個過程中,Prdx6的表達量始終是低于假手術組水平的。(5)Q-PCR結果顯示:與假手術組相比,TNF-α的基因水平在SCI后6h、1d和14d呈顯著性上升(P0.05)。然而,在SCI后,Prdx6的m RNA水平卻呈現(xiàn)持續(xù)性的下降。(6)WB結果顯示:與假手術組相比,TNF-α蛋白表達在脊髓損傷后12h時明顯上升(P0.05),此后,1d,3d和7d與假手術組相比仍然升高。與假手術組相比,Prdx6蛋白表達在脊髓損傷后呈現(xiàn)持續(xù)性下降(P0.05)。(7)生物信息學方法提示TNF-α和Prdx6基因之間通過活性轉錄因子3(Activating Transcription Factor,ATF3)和活性轉錄因子4(Activating Transcription Factor4,ATF4)產(chǎn)生間接的聯(lián)系。結論本實驗首次觀察到,在脊髓損傷后,過氧化物氧化還原酶6(Prdx6)基因和蛋白降低,Prdx6在脊髓前角運動神經(jīng)元表達。本實驗用生物信息學方法觀察到TNF-α和Prdx6之間具有相互聯(lián)系,TNF-α和Prdx6共同參與了脊髓損傷后的病理過程,與急性脊髓損傷的發(fā)生發(fā)展有關,對脊髓損傷運動功能的恢復具有重要意義。本實驗觀察到在脊髓損傷后,丙二醛MDA和炎癥因子TNF-α在脊髓損傷后立即上升,提示炎癥反應和氧化損傷共同存在,相互作用,是促進脊髓二次損傷的重要因素。TNF-α的基因水平在SCI后6h上升至峰值,其蛋白水平在SCI后12h達到最高水平,而此時脊髓運動功能評分最低,幾乎為0;在SCI后7d時,TNF-α的基因水平和蛋白水平均有所降低,此時,BBB評分較之前升高有統(tǒng)計學意義,提示TNF-α是影響脊髓運動功能恢復的因素。因此,TNF-α具有促進脊髓早期炎癥反應和抑制脊髓損傷運動功能恢復的作用,Prdx6具有抗氧化反應和促進脊髓運動功能的恢復的作用,他們可以作為脊髓損傷的治療靶點,為臨床脊髓損傷治療提供新的選擇。
[Abstract]:Objective To investigate the expression of TNF - 偽 and Prx 6 in spinal cord injury in rats after spinal cord injury , and to investigate the effect of inflammatory injury and oxidative damage on spinal cord injury after spinal cord injury . ( 2 ) The pathological results of HE staining showed that the spinal cord tissue was intact in the sham operation group , the cell morphology was normal , the nucleus and the cytoplasm were stained clearly . ( 5 ) The results of Q - PCR showed that the mRNA level of TNF - 偽 increased significantly at 6h , 1d and 14d after SCI ( P0.05 ) . (7)鐢熺墿淇℃伅瀛︽柟娉曟彁紺篢NF-偽鍜孭rdx6鍩哄洜涔嬮棿閫氳繃媧繪，

本文編號：1925887