本文選題：骨再生 + 艾地骨化醇��； 參考：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景:創(chuàng)傷、拔牙、感染等原因造成的骨缺損是臨床亟待解決的難題之一。臨床上骨缺損的修復(fù)方法主要包括骨搬運(yùn)術(shù)、骨移植等手術(shù)治療以及物理療法。眾所周知,骨搬運(yùn)術(shù)的手術(shù)復(fù)雜、易伴發(fā)感染;自體骨移植的骨源受限,對供體造成新的骨缺損;異體骨移植易誘發(fā)排異反應(yīng)。因此,尋找一種并發(fā)癥少、利于成骨、操作簡單的修復(fù)方法可能會(huì)為臨床骨缺損的治療提供新的方向。課題組先前的研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)用化學(xué)療法治療骨缺損方法較為安全、簡單、有效。1α,25-dihydroxyvitamin D3(1,25(OH)2D3)是維生素 D 的一種活性形式,明顯抑制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松。骨質(zhì)疏松是以骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征的一組全身性骨骼疾病,而骨量的減少主要是由于骨吸收所致�？蒲腥藛T發(fā)現(xiàn)活性維生素D能夠明顯降低骨質(zhì)疏松患者骨折的風(fēng)險(xiǎn)。近年來,眾多的活性維生素D類似物在原有的藥物基礎(chǔ)上進(jìn)行了藥學(xué)性能的優(yōu)化。本課題中所使用的艾地骨化醇(Eldecalcitol,ELD)是一種新型活性維生素D類似物,其與維生素D受體(Vitamin D receptor,VDR)的親和力較低,而與維生素D結(jié)合蛋白(Vitamin D binding protein,DBP)的親和力較高。因此,艾地骨化醇具有作用持久和利用率高的特性。研究發(fā)現(xiàn)艾地骨化醇明顯地抑制骨吸收以及增加骨密度,此外,艾地骨化醇可以誘導(dǎo)"迷你型塑造"骨形成,而不依賴破骨細(xì)胞的骨吸收過程。因此在2011年艾地骨化醇被批準(zhǔn)為治療骨質(zhì)疏松癥的藥物。艾地骨化醇具有抑制骨吸收增加骨量的特性,因此艾地骨化醇在治療骨質(zhì)疏松癥方面一直備受關(guān)注,但是其在骨缺損修復(fù)方面的研究甚少。骨缺損愈合是一個(gè)多細(xì)胞參與,多種信號(hào)在時(shí)間和空間上精密調(diào)控的復(fù)雜的生物學(xué)過程。與骨質(zhì)疏松不同的是,骨缺損愈合不僅包括骨量的恢復(fù),而且包括骨質(zhì)的成熟。成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞是骨再生的三大功能細(xì)胞,在骨缺損愈合過程中扮演著不可替代的角色。因此,本課題利用艾地骨化醇抑制骨吸收的特性來治療局部骨缺損,以期獲得良好的治療效果,并且建立骨缺損模型研究艾地骨化醇對三大功能細(xì)胞影響,從而探討其對骨缺損愈合的影響,并期望該研究成果能為臨床骨缺損的治療提供一定的理論基礎(chǔ)及新的思路。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?本課題通過制備骨缺損模型,旨在探討系統(tǒng)性應(yīng)用艾地骨化醇對成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞的影響及其相關(guān)機(jī)制,彌補(bǔ)艾地骨化醇在骨缺損修復(fù)方面的研究空缺,為臨床骨缺損的治療提供一定的理論基礎(chǔ)及新的思路。實(shí)驗(yàn)方法:將48只8周齡雄性Wistar大鼠(體重180-220g)隨機(jī)分為對照組(CON組)和艾地骨化醇組(ELD組),每組24只。所有動(dòng)物全麻后于雙側(cè)股骨中段分別制備大小為1mm×3mm×5mm(深度×寬度×長度)的骨缺損,并在骨缺損表面覆蓋膠原膜。ELD組術(shù)后通過灌胃方式給予艾地骨化醇(劑量為50ng/kg),CON組投給等量的脂肪酸,隔日給藥一次。24只大鼠分別于術(shù)后1、2、4和8周處死并取材(n=6),提取蛋白和mRNA,利用Western blot檢測RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,核因子 kB 受體活化因子配體)、OPG(Osteoprotegerin,骨保護(hù)素)和OCN蛋白的表達(dá)情況;利用RT-PCR檢測RANKL、OPG和OCN mRNA的表達(dá)水平。24只大鼠分別于術(shù)后1、2、4和8周處死并取材(n=6),經(jīng)石蠟包埋后制備5μm的連續(xù)切片。通過HE染色進(jìn)行新生骨大體形態(tài)學(xué)觀察;通過馬松染色檢測新生骨中非成熟骨組織所占比例;通過TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶)染色方法檢測破骨細(xì)胞數(shù)目;利用免疫組織化學(xué)染色方法檢測 ALP(Alkaline phosphatase,堿性磷酸酶)、CK(CathepsinK,組織蛋白酶 K)、OCN(Osteocalcin,骨鈣素)、DMP1(Dentin matrix protein 1,牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1)和FGF23(Fibroblast growth factor23,成纖維生長因子23)的表達(dá)情況。本課題通過檢測上述因子,探討艾地骨化醇對骨形成以及骨礦化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.ELD增加新生骨骨量骨缺損區(qū)域HE染色結(jié)果顯示:在骨缺損愈合的早期(1、2周),大量纖維結(jié)締組織和新生編織骨充填整個(gè)骨缺損部位,ELD組新生編織骨骨量明顯高于CON組;在骨缺損愈合的后期(4、8周),4周ELD組新生骨骨量高于CON組,8周CON組和ELD組之間骨量無明顯差異。2.ELD對成骨和破骨功能的影響骨缺損區(qū)域ALP/TRAP雙重染色結(jié)果顯示:在骨缺損愈合的早期(1、2周),ELD組ALP的表達(dá)明顯多于CON組。CON組TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)目明顯高于ELD組,破骨細(xì)胞深染、體積大且呈現(xiàn)多核,提示破骨功能活躍;在骨缺損愈合的后期(4、8周),ELD組ALP的表達(dá)多于CON組,CON組TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)目有所降低但仍然高于ELD組。骨缺損區(qū)域CK免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:在骨缺損愈合的早期(1、2周),CON組CK陽性破骨細(xì)胞數(shù)目明顯多于ELD組,并且ELD組的CK陽性破骨細(xì)胞與骨組織表面附著不甚緊密,體積較小胞體扁平;在骨缺損愈合的后期(4、8周),CON組CK陽性破骨細(xì)胞數(shù)目有所減低但仍然高于ELD組。骨缺損區(qū)域RANKL、OPG蛋白的Western blot結(jié)果顯示:在骨缺損愈合的早期(1、2周)和后期(4、8周),與CON組相比,ELD組RANKL蛋白的表達(dá)水平明顯降低,OPG蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào),并且ELD組RANKL/OPG的比例明顯降低。骨缺損區(qū)域RANKL、OPG mRNA的RT-PCR結(jié)果顯示:在骨缺損愈合的早期(1、2周)和后期(4、8周),ELD明顯地下調(diào)RANKLmRNA的表達(dá),促進(jìn)OPG mRNA的表達(dá),并且ELD組RANKL/OPG的比例顯著降低。3.ELD對新骨成熟程度的影響骨缺損區(qū)域馬松染色結(jié)果顯示:在骨缺損愈合的早期(1、2周),1周CON組和ELD組之間未成熟骨組織所占比例(COI/TV)無明顯差異,2周CON組未成熟骨組織所占比例(COL/TV)高于ELD組;在骨缺損愈合的后期(4、8周),ELD組骨缺損部位可見大量帶狀紅染的成熟骨組織,并且新生骨裂縫較少骨質(zhì)平滑細(xì)密,ELD組的未成熟骨組織的比例(COL/TV)明顯低于CON組。4.ELD對成骨細(xì)胞礦化因子的影響骨缺損區(qū)域OCN免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:在骨缺損愈合的早期(1、2周),1周CON組和ELD組骨基質(zhì)OCN的表達(dá)無明顯差異,2周ELD組成骨細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)OCN的表達(dá)明顯多于CON組;在骨缺損愈合的后期(4、8周),ELD組OCN主要分布在骨基質(zhì)中且表達(dá)量明顯高于CON組。骨缺損區(qū)域OCN蛋白的Western blot結(jié)果顯示:在骨缺損愈合的早期(1、2周),1周CON組和ELD組OCN的表達(dá)無明顯差異,2周ELD組OCN蛋白的表達(dá)較CON組有所增加;在骨缺損愈合的后期(4、8周),ELD組OCN蛋白的表達(dá)水平明顯高于CON組。骨缺損區(qū)域OCNmRNA的RT-PCR結(jié)果顯示:在骨缺損愈合的早期(1、2周)和后期(4、8周),ELD明顯促進(jìn)OCNmRNA的表達(dá)。5.ELD對骨細(xì)胞礦化因子的影響骨缺損區(qū)域DMP1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:在骨缺損愈合的后期(4、8周),CON組骨細(xì)胞排列較紊亂,而ELD組的骨細(xì)胞排列較為整齊有序,ELD組的DMP1陽性骨細(xì)胞數(shù)目顯著多于CON組。骨缺損區(qū)域的FGF23免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:在骨缺損愈合的后期(4、8周),ELD組FGF23陽性骨細(xì)胞數(shù)目顯著低于CON組。結(jié)論:1.艾地骨化醇一方面通過下調(diào)RANKL的表達(dá),降低RANKL/OPG的比例,抑制破骨細(xì)胞生成和骨吸收;另一方面通過促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨形成,加速骨缺損的愈合。2.艾地骨化醇一方面通過促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化相關(guān)因子OCN的表達(dá),促進(jìn)新骨礦化;另一方面通過促進(jìn)骨細(xì)胞礦化相關(guān)因子DMP1的表達(dá),間接抑制骨細(xì)胞礦化相關(guān)因子FGF23的表達(dá),促進(jìn)新骨礦化,加速骨缺損愈合。
[Abstract]:Bone defect healing is a new type of active vitamin D analogue , which is a new active vitamin D analogue . Objective : To study the effect of Etopoiosanol on bone defect healing by means of immunohistochemical staining . The aim of this study was to investigate the effect of Etopoiosanol on bone defect healing . In the early stage ( 1 , 2 weeks ) and late stage ( 4 , 8 weeks ) of bone defect healing , there was no significant difference in bone mass between CON group and ELD group .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R681

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本文編號(hào)：1904388