本文選題：長鏈非編碼RNA-UFC1 + 骨性關(guān)節(jié)炎��； 參考：《山東大學》2017年博士論文

【摘要】：研究背景骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨細胞減少及關(guān)節(jié)基質(zhì)破壞為主要病理特點很常見的退行性病變,骨關(guān)節(jié)炎嚴重的患病者可導致關(guān)節(jié)畸形及功能完全喪失。該病主要發(fā)生于中老年人群,是老年患者臨床最常見的關(guān)節(jié)類疾病,流行病學統(tǒng)計結(jié)果顯示我國40歲以上人群的OA患病率約為30%,65歲以上可達60%～70%。隨著我國社會人口老齡化問題的突出,該數(shù)據(jù)仍繼續(xù)在不斷提升中,已成為越來越備受關(guān)注的社會問題。目前,該病尚無明確且有效的根治性的治療手段,臨床上采取的治療手段主要以控制疼痛、改善關(guān)節(jié)的功能和提高生活質(zhì)量為主要目的,首選藥物及理療等保守療法,當保守治療無效時,可行關(guān)節(jié)鏡下關(guān)節(jié)清理、軟骨移植和關(guān)節(jié)置換等外科療法。新的流行病學證據(jù)表明OA的發(fā)生與發(fā)展除了與年齡直接相關(guān)以外,還受到諸多可調(diào)節(jié)因素的影響,具有可預防和可治療性。鑒于其病理進程較為復雜,涉及到的機制也具有多樣化特征,針對OA的不同病理進程及其相關(guān)機制,一些新的治療方案,如軟骨細胞移植術(shù)、骨髓間充質(zhì)干細胞移植術(shù)、基質(zhì)誘導自體軟骨細胞移植術(shù)等已部分進行了臨床開展,并獲得了一些效果,但仍不是十分理想。是以更深入研究OA的病理機制,挖掘更為確切的防治靶點,仍然是當前需要解決的一個難題。長鏈非編碼RNA((Long non coding RNA,Lnc RNA)是非編碼RNA的一個亞類,長度超過200nt,較編碼RNA具有更強的組織特異性和細胞特異性,在不同細胞、組織及其不同發(fā)育階段,表達均有不同,與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。部分學者指出Lnc RNA在OA發(fā)病過程中介導重要機制,并通過基因芯片與高通量DNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在軟骨分化過程中有2166個Lnc RNA表達上調(diào),1472個Lnc RNA表達下調(diào),為OA的臨床治療提供了新的希望。目前,關(guān)于LncRNA在OA的作用已有較多研究,但病理學方面仍然有許多未知之處需深入探索。在既往的前期研究工作中也發(fā)現(xiàn)OA患者軟骨細胞的LncRNA-UFC1表達水平低于正常軟骨細胞。在腫瘤性疾病中,UFC1能通過與miR-34a特異性結(jié)合而抑制其活性,解除miR-34a對細胞增殖的抑制作用。miR-34a過表達同時也是OA患者軟骨細胞凋亡和再生障礙的一個重要誘因,但在OA中,UFC1是否能夠與miR-34a特異性結(jié)合,從而促進軟骨細胞增殖尚不得知。本研究分三部分內(nèi)容,首先觀察Lnc-RNA-UFC1對關(guān)節(jié)炎性海綿狀軟骨細胞增殖與凋亡行為的影響,分析Lnc-RNA-UFC1在OA病理機制的是否發(fā)揮了重要作用,確立其研究價值;其次從Lnc-RNA-UFC1與miR-34a相互調(diào)控的角度分析其作用途徑,確定Lnc-RNA-UFC1對OA病理機制介導是否是通過miR-34a來完成的;最后選取miR-34a調(diào)節(jié)OA的相關(guān)下游信號分子,對Lnc-RNA-UFC1通過miR-34a促進軟骨細胞增殖的機制做初步探討,最終為完善OA病理機制和探尋新的治療靶點提供依據(jù)。研究目的觀察Lnc-RNA-UFC1對關(guān)節(jié)炎性海綿狀軟骨細胞增殖與凋亡行為的影響,并從Lnc-RNA-UFC1與miR-34a相互調(diào)控的角度分析其作用途徑,為完善OA病理機制和探尋新的治療靶點提供依據(jù)。研究方法1.OA軟骨細胞的體外培養(yǎng)和樣本選取以30名行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的OA患病者為病理對象取其OA軟骨細胞,20例不曾患OA或者RA(類風濕性關(guān)節(jié)炎)預行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的股骨頸骨折患者的正常軟骨細胞做為對照組,術(shù)中留取軟骨組織。采用兩步酶消化法分離人的軟骨細胞,并進行傳代培養(yǎng),取2、3、4代細胞各培養(yǎng)14 d,制備生長曲線,并采用免疫組織化學實驗測定軟骨細胞Ⅱ型膠原的表達情況,選取生長良好、Ⅱ型膠原充足的細胞納入樣本。2.OA軟骨細胞和正常軟骨細胞的UFC1表達和行為學特征納入實驗的OA軟骨細胞和正常軟骨細胞,采用96孔板培養(yǎng),37℃,5%CO2培養(yǎng)48 h,采用定量實時PCR實驗測定UFC1表達水平,采用CCK-8細胞增殖活力實驗測定細胞增殖活力,采用Annexin V和PI雙染流式細胞實驗測定細胞凋亡率,對比各個指標的組間差異。3.UFC1過表達和沉默對行為學特征的影響采用siRNA技術(shù)分別構(gòu)建UFC1過表達(UFC1 overexpression)和UFC1干擾慢病毒載體質(zhì)粒(簡稱為shRNA1與shRNA2),轉(zhuǎn)染至OA軟骨細胞。96孔板培養(yǎng)細胞,設(shè)立對照組(Controls1),空載質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組(Controls 2)、UFC1組過表達組(UFC1 over expression)及 UFC1 沉默組(shRNA1 與 shRNA2)。Controls 1僅含OA軟骨細胞、Controls 2加入空載質(zhì)粒和脂質(zhì)體共培養(yǎng)、UFC1 over expression、shRNA1及shRNA2分別加入相應的UFC1-siRNA-脂質(zhì)體復合物進行共培養(yǎng),37℃,5%CO2共培養(yǎng)48h,對比各組細胞細胞增殖活力、細胞凋亡率,繼續(xù)培養(yǎng),繪制14 d生長曲線。4.OA軟骨細胞中UFC1與miR-34a的相關(guān)性考察納入實驗的OA軟骨細胞和正常軟骨細胞,37℃,5%CO2培養(yǎng)48h,采用定量實時PCR實驗測定miR-34a表達水平,分析miR-34a mRNA表達與UFC1 mRNA表達的相關(guān)性。5.OA軟骨細胞UFC1與miR-34a的相互作用使用脂質(zhì)體 2000 將 pcDNA3.1-MS2,pcDNA3.1-MS2-UFC1 或者pcDNA3.1-MS2-UFC1-mut 和 pMS2-GFP 細胞進行共轉(zhuǎn)染,37℃,5%CO2培養(yǎng)48 h后,再以EZ-Magna RIPRNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒對細胞使用GFP抗體進行RIP分析。并將原代或者變異全長型UFC1克隆到pmirGLO質(zhì)粒受體中,以上所有原代與變異的受體攜帶體和模擬生物體內(nèi)源miR-34a均被導入細胞中,在37℃,5%CO2培養(yǎng)48 h后,通過雙熒光素酶受體分析系統(tǒng)測量熒光素活性。6.UFC1通過miR-34a調(diào)控OA軟骨細胞的行為學特征進行靶向干預實驗,96孔板培養(yǎng)細胞,設(shè)立對照組(Controls)、UFC1沉默組(shRNA1 與 shRNA2)、miR-34a 抑制劑干預組(miR-34a inhibitor)、UFC1過表達組(UFC]over expression)和 miR-34a 干預組(miR-34a);Controls 正常培養(yǎng);shRNA1、shRNA2 和 miR-34a inhibitor 均采用 siRNA 實驗構(gòu)建 UFC1 干擾質(zhì)粒,且 miR-34a inhibitor 額外添加 miR-34a 抑制劑;UFC 1 over expression 和miR-34a均采用siRNA實驗構(gòu)建UFC1過表達質(zhì)粒,且miR-34a額外添加miR-34a,37℃,5%C02培養(yǎng)48 h,測定細胞增殖活力、凋亡率及14d生長曲線。7.UFC1通過miR-34a調(diào)控OA軟骨細胞的行為學的機制研究進行靶向干預實驗,96孔板培養(yǎng)細胞,設(shè)立對空白對照組(Controls 1)、空載質(zhì)粒組(Controls2)、UFC1 沉默組(shRNA)、miR-34a 抑制劑組(miR-34a inhibitor)。Controls 1僅OA軟骨細胞;Controls 2同時含有OA軟骨細胞和空白脂質(zhì)體質(zhì)粒;shRNA以siRNA轉(zhuǎn)染實驗沉默UFCI(取第一、二部分實驗的shRNA1,重新命名為shRNA),miR-34a inhibitor在沉默UFC1的基礎(chǔ)上加入miR-34ainhibitor,37℃,5%CO2,培養(yǎng)72h分別以熒光定量PCR實驗和免疫蛋白印跡(WB)實驗測定 ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-9、MMP-13的mRNA表達水平及蛋白表達水平。研究結(jié)果1.OA軟骨細胞的體外培養(yǎng)和樣本選取軟骨細胞于培養(yǎng)的第3d左右開始生長,7～10 d生長速率達到頂峰,之后由于進入減速期,第2、3代細胞的生長狀況明顯優(yōu)于4代。對各代細胞的Ⅱ型膠原進行免疫組織化學染色實驗,2代細胞著色良好;3代細胞著色減弱,但仍見較清晰的陽性細胞;4代細胞著色差,已發(fā)生較大程度的變異,故以第2、3代細胞作為主要樣本。2.OA軟骨細胞和正常軟骨細胞的UFC1表達和行為學特征OA患者軟骨細胞的UFC1 mRNA表達水平明顯低于正常軟骨細胞,細胞增殖活力低于正常的軟骨細胞,細胞凋亡率高于正常的軟骨細胞,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。3.UFC1過表達和基因沉默對行為學特征的影響UFC1過表達組OA軟骨細胞組的UFC1表達量明顯高于未轉(zhuǎn)染組(Controls 1,P0.01),同時,細胞生長速率和增殖活力明顯提高,凋亡率降低,與Controls 1相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);shRNA1和shRNA2 OA軟骨細胞的UFC1表達量明顯低于未基因沉默者(Controls1,P0.01),同時,細胞生長速率和增殖活力明顯降低,凋亡率升高,與Controls1相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。4.OA軟骨細胞中UFC1與miR-34a的相關(guān)性考察OA患者軟骨細胞miR-34a mRNA表達水平明顯高于正常軟骨細胞(P0.05),進一步分析結(jié)果顯示,OA患者軟骨細胞miR-34amRNA表達與UFC1 mRNA表達具有負相關(guān)性(R2 = 0.6173,P0.05)。5.OA軟骨細胞UFC1與miR-34a的相互作用RIP法下調(diào)UFC1的內(nèi)源性microRNA水平后,UFCI在軟骨組織中的RIP水平與空白組相比miR-34a水平顯著增加(MS2),UFCI在miR-34a作用靶點發(fā)生突變(UFCI-mut)。熒光素酶受體分析結(jié)果顯示miR-34a的過度表達減少了原代受體因子的熒光素酶活性,而不是空載體或者突變受體載體。由AG02下調(diào)的UFC1在miR-34a過度表達的細胞中含量顯著增加,且原代UFC1過度表達而并非變異體抑制了 miR-34a水平。6.UFC1通過miR-34a調(diào)控OA軟骨細胞的行為學特征與Controls相比,shRNA1和shRNA2 OA軟骨細胞的生長速率減慢,增殖活力降低,凋亡率升高;給予miR-34a inhibitor后,OA軟骨細胞的生長速率增快,增殖活力升高,凋亡率降低;各組間的比較明顯存在統(tǒng)計學差異(P0.01)。與Controls相比,UFC1 over expression OA軟骨細胞的生長速率增快,增殖活力升高,凋亡率降低;經(jīng)miR-34a干預后,OA軟骨細胞的生長速率減低,增殖活力降低,凋亡率升高,組間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。7.UFC1通過miR-34a調(diào)控OA軟骨細胞的行為學的機制研究與Control 1相比,Control 2的各個指標水平差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05);shRNA的ADAMTS-4 mRNA和蛋白表達水平明顯升高,而給予miR-34a抑制劑后(miR-34ainhibitor)明顯降低,組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);而同法測定shRNA的ADAMTS-5 mRNA組間均無統(tǒng)計學意義(P0.05);shRNA的MMP-3、MMP-9與MMP-13mRNA和蛋白表達水平明顯升高,而給予miR-34a抑制劑后(miR-34a inhibitor)明顯降低,均發(fā)現(xiàn)組間的差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論1.本研究對OA軟骨細胞和正常軟骨細胞的LncRNA-UFC1表達情況進行考察,并通過獲得性喪失研究LncRNA-UFC1對軟骨細胞的行為學的影響,發(fā)現(xiàn)LncRNA-UFC1能夠促進OA軟骨細胞的增殖活性,抑制其凋亡率,促進軟骨細胞生長,在OA的病理機制中可能介導重要作用。2.LncRNA-UFC1 對 OA 病理的調(diào)控可能與 miR-34a 有關(guān),LncRNA-UFC1與miR-34a結(jié)合后使其表達沉默,功能受到抑制,從而促進了 OA軟骨組織的細胞增殖并抑制其細胞凋亡,對該機制的深入研究,有可能會為OA的臨床上的診治提出新的靶點。3.LncRNA-UFC1與miR-34a結(jié)合后,能抑制其下游信號分子ADAMTS-4、MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達,從而緩解細胞外基質(zhì)降解和軟骨組織破壞,可能為其抗OA機制的重要構(gòu)成部分之一。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R684.3

【參考文獻】

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本文編號：1883089