本文選題：長鏈非編碼RNA-UFC1 + 骨性關(guān)節(jié)炎�。� 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞減少及關(guān)節(jié)基質(zhì)破壞為主要病理特點(diǎn)很常見的退行性病變,骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重的患病者可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能完全喪失。該病主要發(fā)生于中老年人群,是老年患者臨床最常見的關(guān)節(jié)類疾病,流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示我國40歲以上人群的OA患病率約為30%,65歲以上可達(dá)60%～70%。隨著我國社會(huì)人口老齡化問題的突出,該數(shù)據(jù)仍繼續(xù)在不斷提升中,已成為越來越備受關(guān)注的社會(huì)問題。目前,該病尚無明確且有效的根治性的治療手段,臨床上采取的治療手段主要以控制疼痛、改善關(guān)節(jié)的功能和提高生活質(zhì)量為主要目的,首選藥物及理療等保守療法,當(dāng)保守治療無效時(shí),可行關(guān)節(jié)鏡下關(guān)節(jié)清理、軟骨移植和關(guān)節(jié)置換等外科療法。新的流行病學(xué)證據(jù)表明OA的發(fā)生與發(fā)展除了與年齡直接相關(guān)以外,還受到諸多可調(diào)節(jié)因素的影響,具有可預(yù)防和可治療性。鑒于其病理進(jìn)程較為復(fù)雜,涉及到的機(jī)制也具有多樣化特征,針對OA的不同病理進(jìn)程及其相關(guān)機(jī)制,一些新的治療方案,如軟骨細(xì)胞移植術(shù)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植術(shù)、基質(zhì)誘導(dǎo)自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)等已部分進(jìn)行了臨床開展,并獲得了一些效果,但仍不是十分理想。是以更深入研究OA的病理機(jī)制,挖掘更為確切的防治靶點(diǎn),仍然是當(dāng)前需要解決的一個(gè)難題。長鏈非編碼RNA((Long non coding RNA,Lnc RNA)是非編碼RNA的一個(gè)亞類,長度超過200nt,較編碼RNA具有更強(qiáng)的組織特異性和細(xì)胞特異性,在不同細(xì)胞、組織及其不同發(fā)育階段,表達(dá)均有不同,與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。部分學(xué)者指出Lnc RNA在OA發(fā)病過程中介導(dǎo)重要機(jī)制,并通過基因芯片與高通量DNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在軟骨分化過程中有2166個(gè)Lnc RNA表達(dá)上調(diào),1472個(gè)Lnc RNA表達(dá)下調(diào),為OA的臨床治療提供了新的希望。目前,關(guān)于LncRNA在OA的作用已有較多研究,但病理學(xué)方面仍然有許多未知之處需深入探索。在既往的前期研究工作中也發(fā)現(xiàn)OA患者軟骨細(xì)胞的LncRNA-UFC1表達(dá)水平低于正常軟骨細(xì)胞。在腫瘤性疾病中,UFC1能通過與miR-34a特異性結(jié)合而抑制其活性,解除miR-34a對細(xì)胞增殖的抑制作用。miR-34a過表達(dá)同時(shí)也是OA患者軟骨細(xì)胞凋亡和再生障礙的一個(gè)重要誘因,但在OA中,UFC1是否能夠與miR-34a特異性結(jié)合,從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖尚不得知。本研究分三部分內(nèi)容,首先觀察Lnc-RNA-UFC1對關(guān)節(jié)炎性海綿狀軟骨細(xì)胞增殖與凋亡行為的影響,分析Lnc-RNA-UFC1在OA病理機(jī)制的是否發(fā)揮了重要作用,確立其研究價(jià)值;其次從Lnc-RNA-UFC1與miR-34a相互調(diào)控的角度分析其作用途徑,確定Lnc-RNA-UFC1對OA病理機(jī)制介導(dǎo)是否是通過miR-34a來完成的;最后選取miR-34a調(diào)節(jié)OA的相關(guān)下游信號分子,對Lnc-RNA-UFC1通過miR-34a促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的機(jī)制做初步探討,最終為完善OA病理機(jī)制和探尋新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。研究目的觀察Lnc-RNA-UFC1對關(guān)節(jié)炎性海綿狀軟骨細(xì)胞增殖與凋亡行為的影響,并從Lnc-RNA-UFC1與miR-34a相互調(diào)控的角度分析其作用途徑,為完善OA病理機(jī)制和探尋新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。研究方法1.OA軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)和樣本選取以30名行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的OA患病者為病理對象取其OA軟骨細(xì)胞,20例不曾患OA或者RA(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)預(yù)行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的股骨頸骨折患者的正常軟骨細(xì)胞做為對照組,術(shù)中留取軟骨組織。采用兩步酶消化法分離人的軟骨細(xì)胞,并進(jìn)行傳代培養(yǎng),取2、3、4代細(xì)胞各培養(yǎng)14 d,制備生長曲線,并采用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)測定軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的表達(dá)情況,選取生長良好、Ⅱ型膠原充足的細(xì)胞納入樣本。2.OA軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞的UFC1表達(dá)和行為學(xué)特征納入實(shí)驗(yàn)的OA軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞,采用96孔板培養(yǎng),37℃,5%CO2培養(yǎng)48 h,采用定量實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)測定UFC1表達(dá)水平,采用CCK-8細(xì)胞增殖活力實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞增殖活力,采用Annexin V和PI雙染流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞凋亡率,對比各個(gè)指標(biāo)的組間差異。3.UFC1過表達(dá)和沉默對行為學(xué)特征的影響采用siRNA技術(shù)分別構(gòu)建UFC1過表達(dá)(UFC1 overexpression)和UFC1干擾慢病毒載體質(zhì)粒(簡稱為shRNA1與shRNA2),轉(zhuǎn)染至OA軟骨細(xì)胞。96孔板培養(yǎng)細(xì)胞,設(shè)立對照組(Controls1),空載質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組(Controls 2)、UFC1組過表達(dá)組(UFC1 over expression)及 UFC1 沉默組(shRNA1 與 shRNA2)。Controls 1僅含OA軟骨細(xì)胞、Controls 2加入空載質(zhì)粒和脂質(zhì)體共培養(yǎng)、UFC1 over expression、shRNA1及shRNA2分別加入相應(yīng)的UFC1-siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物進(jìn)行共培養(yǎng),37℃,5%CO2共培養(yǎng)48h,對比各組細(xì)胞細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞凋亡率,繼續(xù)培養(yǎng),繪制14 d生長曲線。4.OA軟骨細(xì)胞中UFC1與miR-34a的相關(guān)性考察納入實(shí)驗(yàn)的OA軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞,37℃,5%CO2培養(yǎng)48h,采用定量實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)測定miR-34a表達(dá)水平,分析miR-34a mRNA表達(dá)與UFC1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性。5.OA軟骨細(xì)胞UFC1與miR-34a的相互作用使用脂質(zhì)體 2000 將 pcDNA3.1-MS2,pcDNA3.1-MS2-UFC1 或者pcDNA3.1-MS2-UFC1-mut 和 pMS2-GFP 細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染,37℃,5%CO2培養(yǎng)48 h后,再以EZ-Magna RIPRNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒對細(xì)胞使用GFP抗體進(jìn)行RIP分析。并將原代或者變異全長型UFC1克隆到pmirGLO質(zhì)粒受體中,以上所有原代與變異的受體攜帶體和模擬生物體內(nèi)源miR-34a均被導(dǎo)入細(xì)胞中,在37℃,5%CO2培養(yǎng)48 h后,通過雙熒光素酶受體分析系統(tǒng)測量熒光素活性。6.UFC1通過miR-34a調(diào)控OA軟骨細(xì)胞的行為學(xué)特征進(jìn)行靶向干預(yù)實(shí)驗(yàn),96孔板培養(yǎng)細(xì)胞,設(shè)立對照組(Controls)、UFC1沉默組(shRNA1 與 shRNA2)、miR-34a 抑制劑干預(yù)組(miR-34a inhibitor)、UFC1過表達(dá)組(UFC]over expression)和 miR-34a 干預(yù)組(miR-34a);Controls 正常培養(yǎng);shRNA1、shRNA2 和 miR-34a inhibitor 均采用 siRNA 實(shí)驗(yàn)構(gòu)建 UFC1 干擾質(zhì)粒,且 miR-34a inhibitor 額外添加 miR-34a 抑制劑;UFC 1 over expression 和miR-34a均采用siRNA實(shí)驗(yàn)構(gòu)建UFC1過表達(dá)質(zhì)粒,且miR-34a額外添加miR-34a,37℃,5%C02培養(yǎng)48 h,測定細(xì)胞增殖活力、凋亡率及14d生長曲線。7.UFC1通過miR-34a調(diào)控OA軟骨細(xì)胞的行為學(xué)的機(jī)制研究進(jìn)行靶向干預(yù)實(shí)驗(yàn),96孔板培養(yǎng)細(xì)胞,設(shè)立對空白對照組(Controls 1)、空載質(zhì)粒組(Controls2)、UFC1 沉默組(shRNA)、miR-34a 抑制劑組(miR-34a inhibitor)。Controls 1僅OA軟骨細(xì)胞;Controls 2同時(shí)含有OA軟骨細(xì)胞和空白脂質(zhì)體質(zhì)粒;shRNA以siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)沉默UFCI(取第一、二部分實(shí)驗(yàn)的shRNA1,重新命名為shRNA),miR-34a inhibitor在沉默UFC1的基礎(chǔ)上加入miR-34ainhibitor,37℃,5%CO2,培養(yǎng)72h分別以熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)和免疫蛋白印跡(WB)實(shí)驗(yàn)測定 ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-9、MMP-13的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平。研究結(jié)果1.OA軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)和樣本選取軟骨細(xì)胞于培養(yǎng)的第3d左右開始生長,7～10 d生長速率達(dá)到頂峰,之后由于進(jìn)入減速期,第2、3代細(xì)胞的生長狀況明顯優(yōu)于4代。對各代細(xì)胞的Ⅱ型膠原進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn),2代細(xì)胞著色良好;3代細(xì)胞著色減弱,但仍見較清晰的陽性細(xì)胞;4代細(xì)胞著色差,已發(fā)生較大程度的變異,故以第2、3代細(xì)胞作為主要樣本。2.OA軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞的UFC1表達(dá)和行為學(xué)特征OA患者軟骨細(xì)胞的UFC1 mRNA表達(dá)水平明顯低于正常軟骨細(xì)胞,細(xì)胞增殖活力低于正常的軟骨細(xì)胞,細(xì)胞凋亡率高于正常的軟骨細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。3.UFC1過表達(dá)和基因沉默對行為學(xué)特征的影響UFC1過表達(dá)組OA軟骨細(xì)胞組的UFC1表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)染組(Controls 1,P0.01),同時(shí),細(xì)胞生長速率和增殖活力明顯提高,凋亡率降低,與Controls 1相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);shRNA1和shRNA2 OA軟骨細(xì)胞的UFC1表達(dá)量明顯低于未基因沉默者(Controls1,P0.01),同時(shí),細(xì)胞生長速率和增殖活力明顯降低,凋亡率升高,與Controls1相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。4.OA軟骨細(xì)胞中UFC1與miR-34a的相關(guān)性考察OA患者軟骨細(xì)胞miR-34a mRNA表達(dá)水平明顯高于正常軟骨細(xì)胞(P0.05),進(jìn)一步分析結(jié)果顯示,OA患者軟骨細(xì)胞miR-34amRNA表達(dá)與UFC1 mRNA表達(dá)具有負(fù)相關(guān)性(R2 = 0.6173,P0.05)。5.OA軟骨細(xì)胞UFC1與miR-34a的相互作用RIP法下調(diào)UFC1的內(nèi)源性microRNA水平后,UFCI在軟骨組織中的RIP水平與空白組相比miR-34a水平顯著增加(MS2),UFCI在miR-34a作用靶點(diǎn)發(fā)生突變(UFCI-mut)。熒光素酶受體分析結(jié)果顯示miR-34a的過度表達(dá)減少了原代受體因子的熒光素酶活性,而不是空載體或者突變受體載體。由AG02下調(diào)的UFC1在miR-34a過度表達(dá)的細(xì)胞中含量顯著增加,且原代UFC1過度表達(dá)而并非變異體抑制了 miR-34a水平。6.UFC1通過miR-34a調(diào)控OA軟骨細(xì)胞的行為學(xué)特征與Controls相比,shRNA1和shRNA2 OA軟骨細(xì)胞的生長速率減慢,增殖活力降低,凋亡率升高;給予miR-34a inhibitor后,OA軟骨細(xì)胞的生長速率增快,增殖活力升高,凋亡率降低;各組間的比較明顯存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。與Controls相比,UFC1 over expression OA軟骨細(xì)胞的生長速率增快,增殖活力升高,凋亡率降低;經(jīng)miR-34a干預(yù)后,OA軟骨細(xì)胞的生長速率減低,增殖活力降低,凋亡率升高,組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。7.UFC1通過miR-34a調(diào)控OA軟骨細(xì)胞的行為學(xué)的機(jī)制研究與Control 1相比,Control 2的各個(gè)指標(biāo)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);shRNA的ADAMTS-4 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高,而給予miR-34a抑制劑后(miR-34ainhibitor)明顯降低,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而同法測定shRNA的ADAMTS-5 mRNA組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);shRNA的MMP-3、MMP-9與MMP-13mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高,而給予miR-34a抑制劑后(miR-34a inhibitor)明顯降低,均發(fā)現(xiàn)組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.本研究對OA軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞的LncRNA-UFC1表達(dá)情況進(jìn)行考察,并通過獲得性喪失研究LncRNA-UFC1對軟骨細(xì)胞的行為學(xué)的影響,發(fā)現(xiàn)LncRNA-UFC1能夠促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞的增殖活性,抑制其凋亡率,促進(jìn)軟骨細(xì)胞生長,在OA的病理機(jī)制中可能介導(dǎo)重要作用。2.LncRNA-UFC1 對 OA 病理的調(diào)控可能與 miR-34a 有關(guān),LncRNA-UFC1與miR-34a結(jié)合后使其表達(dá)沉默,功能受到抑制,從而促進(jìn)了 OA軟骨組織的細(xì)胞增殖并抑制其細(xì)胞凋亡,對該機(jī)制的深入研究,有可能會(huì)為OA的臨床上的診治提出新的靶點(diǎn)。3.LncRNA-UFC1與miR-34a結(jié)合后,能抑制其下游信號分子ADAMTS-4、MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達(dá),從而緩解細(xì)胞外基質(zhì)降解和軟骨組織破壞,可能為其抗OA機(jī)制的重要構(gòu)成部分之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R684.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉輝;陳廣潔;;lncRNA與自身免疫病關(guān)系的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2016年06期

2 陶詩聰;郭尚春;張長青;;長鏈非編碼RNA在骨關(guān)節(jié)炎中的作用[J];國際骨科學(xué)雜志;2016年06期

3 吳國翠;;長鏈非編碼RNA在風(fēng)濕性疾病中的免疫調(diào)節(jié)作用[J];中華疾病控制雜志;2016年11期

4 冀全博;徐亞夢;王巖;;miRNA與骨關(guān)節(jié)炎軟骨基質(zhì)降解的研究進(jìn)展[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2016年11期

5 荊琳;單鵬程;張洪美;王秀均;;膝骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織與血漿中miRNA表達(dá)變化及意義[J];山東醫(yī)藥;2016年37期

6 陸啟榮;劉孟軻;李麗;程古月;郝海紅;王旭;戴夢紅;袁宗輝;;畜禽長鏈非編碼RNA的功能及其研究方法[J];中國畜牧獸醫(yī);2016年09期

7 李生強(qiáng);許惠娟;陳娟;謝麗華;謝冰穎;葛繼榮;;絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎陰虛證關(guān)聯(lián)LincRNA uc431+的表達(dá)研究[J];中國骨質(zhì)疏松雜志;2016年08期

8 張文強(qiáng);丁倩;張娜;李月白;;microRNA-34a在大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型中的功能研究[J];重慶醫(yī)學(xué);2016年19期

9 孫紅;張志奇;傅明;;長鏈非編碼RNA在骨關(guān)節(jié)炎與骨腫瘤領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J];中國骨與關(guān)節(jié)雜志;2016年05期

10 孫建琴;陳紅英;姚忠紅;穆敬平;郭俐宏;;電針配合威靈仙關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎MMPs及HA的影響[J];中國中醫(yī)急癥;2016年05期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張國梁;miRNA-502-5p對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷的生物學(xué)作用及機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

2 劉彥廷;長鏈非編碼RNA RP11-838N2.4通過miR-10a調(diào)控腦膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥性的機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

3 張玲;先天性小耳畸形長鏈非編碼RNA和信使RNA的差異表達(dá)分析及調(diào)控關(guān)系的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2016年

4 王峰;長鏈非編碼RNA UCA1在肝癌中的表達(dá)、功能及其調(diào)控機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

5 夏澤楠;骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨祖細(xì)胞功能活性及miRNA表達(dá)譜的改變[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

6 萬中元;長鏈非編碼RNA在退變?nèi)俗甸g盤髓核內(nèi)的異常表達(dá)[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2014年

7 靳雷;miRNA-146a在人正常軟骨細(xì)胞壓力損傷模型中的功能及機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2014年

8 張玉穎;金屬蛋白酶ADAMTS在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和軟骨發(fā)育中的作用[D];山東師范大學(xué);2013年

9 李金平;長鏈非編碼RNA在骨肉瘤患者中的差異表達(dá)研究[D];中南大學(xué);2013年

10 楊曉紅;miR-705對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化功能異常的調(diào)控作用[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前8條

1 段男男;膝骨關(guān)節(jié)炎與正常人血漿microRNA表達(dá)差異研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2016年

2 潘連紅;淫羊藿苷對骨關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞中MMP14表達(dá)和細(xì)胞增殖調(diào)控的研究[D];重慶大學(xué);2016年

3 冀全博;ADAMTS調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變基質(zhì)降解的機(jī)制研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

4 全弘揚(yáng);長鏈非編碼RNA在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中的相關(guān)作用及機(jī)制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

5 孫翔;長鏈非編碼RNA在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中差異表達(dá)的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

6 鄧紫婷;復(fù)元膠囊對實(shí)驗(yàn)性O(shè)A軟骨中TGF-β1、MMPs及ADAMTs的影響[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2014年

7 彭智勇;長鏈非編碼RNA在胰腺導(dǎo)管腺癌表達(dá)譜分析[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2014年

8 馮偉;MMP-3、MMP-13和IL-17在骨關(guān)節(jié)炎滑膜中的表達(dá)及意義[D];鄭州大學(xué);2011年

，

本文編號：1883089