本文選題：分泌型白細(xì)胞蛋白酶抑制因子 + 重組表達(dá)載體��； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：利用干細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行創(chuàng)面修復(fù)機(jī)制及促愈研究已成為創(chuàng)傷領(lǐng)域研究的熱點之一。其中成體干細(xì)胞由于所受倫理限制則較少,并具有明顯的多向分化潛能,因此與之相關(guān)的研究數(shù)量眾多,并且應(yīng)用前景廣闊。成體干細(xì)胞可有多種來源,包括骨髓、脂肪、胰島、皮膚及神經(jīng)組織等。由于皮膚組織更新速度快,再生能力強(qiáng),加之取材方便,用于皮膚等軟組織創(chuàng)面修復(fù)具有相容性好等特點,因此,從局部皮膚獲得的成體干細(xì)胞在對創(chuàng)面修復(fù)的過程中發(fā)揮的作用更加顯著。有研究結(jié)果表明,真皮組織中同樣存在干細(xì)胞,其起源于間質(zhì)細(xì)胞,這類細(xì)胞的增殖能力較強(qiáng),并且能夠轉(zhuǎn)化為多種細(xì)胞,如平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞等。這種類型的細(xì)胞再生能力強(qiáng),是一種多能的干細(xì)胞種類,被稱為真皮多能干細(xì)胞。我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),創(chuàng)面早期傷口液對真皮多能干細(xì)胞具有明確的促增殖作用;整體動物實驗表明,皮膚切割傷大鼠移植真皮多能干細(xì)胞可以縮短創(chuàng)傷愈合時間,對創(chuàng)面修復(fù),包括合并放射性損傷的難愈性創(chuàng)面都具有很好的促愈治療效果。這些結(jié)果提示,真皮多能干細(xì)胞參與了創(chuàng)面修復(fù)過程,是促進(jìn)創(chuàng)面愈合的一種重要修復(fù)細(xì)胞成分,并且真皮多能干細(xì)胞增殖是其促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的重要途徑。分泌型白細(xì)胞蛋白酶抑制因子(secretory leukocyte protease inhibitor,SLPI)是一種可以對抗各種絲氨酸蛋白酶活性的蛋白,其氨基末端具有抗真菌、抗炎及抗菌等方面的活性,而其羧基末端在抑制糜蛋白酶等方面有良好活性表現(xiàn)。有研究表明,SLPI還具有促細(xì)胞增殖作用,也參與細(xì)胞凋亡和免疫功能的調(diào)節(jié)作用,具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等功能。SLPI的這些生物學(xué)作用在某種意義上來說和創(chuàng)面修復(fù)過程之間有著緊密的內(nèi)在聯(lián)系。通過以往研究我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn),真皮多能干細(xì)胞在創(chuàng)面早期傷口液的刺激下增殖速度明顯增加;在基因芯片技術(shù)和抑制消減雜交技術(shù)的幫助下我們發(fā)現(xiàn),在創(chuàng)面早期傷口液作用下,真皮多能細(xì)胞表達(dá)SLPI含量明顯增加;并且創(chuàng)傷局部組織SLPI同樣呈高表達(dá);提示SLPI可能通過促真皮多能干細(xì)胞增殖作用來發(fā)揮調(diào)節(jié)創(chuàng)面修復(fù)過程。為進(jìn)一步證實SLPI在促真皮多能干細(xì)胞增殖的作用,本實驗擬構(gòu)建SLPI基因表達(dá)載體和SLPI基因si RNA表達(dá)載體,通過RT-PCR、western bolt鑒定,并運(yùn)用CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期,以探明SPLI促進(jìn)真皮多能干細(xì)胞的增殖作用及可能機(jī)制。本實驗對創(chuàng)面修復(fù)的研究具有理論意義和潛在的應(yīng)用價值。主要結(jié)果和結(jié)論如下:1.本實驗中分離的真皮多能干細(xì)胞具備形態(tài)單一性,細(xì)胞被分離之后仍然具備較強(qiáng)的增殖能力,并且能夠在外界因素的影響下向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞或者肌細(xì)胞等類型轉(zhuǎn)化。這些結(jié)果提示,本實驗成功分離并擴(kuò)增出大鼠真皮多能干細(xì)胞,并證實其具有自我更新和多向分化潛能。2、通過分子生物學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建SLPI基因過表達(dá)載體,根據(jù)SLPI基因si RNA的設(shè)計挑選出最佳沉默SLPI基因表達(dá)載體,并通過RT-PCR、Western bolt鑒定所構(gòu)建載體,有助于從正反兩個方面來證實SLPI基因的作用。3、SLPI基因重組表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染真皮多能干細(xì)胞,并將其分為過表達(dá)組、干擾組和對照組;檢測CCK-8表達(dá)結(jié)果顯示,SLPI基因有促進(jìn)真皮多能干細(xì)胞增殖作用。流式細(xì)胞檢測細(xì)胞周期結(jié)果表明,過表達(dá)組真皮多能干細(xì)胞G1期與干擾組比較有顯著性差異,G2與S期與對照比較有顯著性差異,SLPI基因具有促使真皮多能干細(xì)胞從G1向S和G2期轉(zhuǎn)變,即SLPI基因通過調(diào)控真皮多能干細(xì)胞周期來發(fā)揮促增殖作用,這些結(jié)果證實了SLPI在創(chuàng)面修復(fù)過程中的作用,并初步探討了其作用環(huán)節(jié)和途徑。
[Abstract]:The present study shows that there are many kinds of stem cells , such as smooth muscle cells , neuron cells , glial cells , fibroblasts and adipose cells . The expression vector of SLPI gene expression vector and SLPI gene were successfully transfected by RT - PCR and Western bolt . The results showed that SLPI gene could promote the proliferation of dermal multipotent stem cells . The results showed that SLPI gene could promote the proliferation of dermal multipotent stem cells .

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R641

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本文編號：1802244