本文選題：肝再生 + 流體切應(yīng)力��； 參考：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：研究背景肝臟參與了人體許多重要的生理活動(代謝、解毒、免疫吞噬等),肝細胞是其完成這些生理活動的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。肝再生能力十分強大,在行部分肝葉切除術(shù)或者發(fā)生重癥肝炎時,肝細胞發(fā)生增殖反應(yīng),使其質(zhì)量/體積恢復(fù)大致如常,以滿足機體正常生理功能的需求。探索肝再生的機制十分重要。目前,有關(guān)肝再生機制的研究有生物化學(xué)學(xué)說和生物力學(xué)學(xué)說兩種：前者如HGF、TGF等多種化學(xué)因子介導(dǎo)的生物化學(xué)信號途徑促進肝細胞的增殖的研究已較為深入；而后者研究相對較少,臨床和實驗研究發(fā)現(xiàn),門靜脈血流動力學(xué)的變化對肝再生也有重要的影響,但是尚未見到生物力學(xué)因素對肝細胞增殖影響的相關(guān)研究。其它組織相關(guān)的生物力學(xué)研究發(fā)現(xiàn),生物力學(xué)信號可通過FAK受體介導(dǎo)影響細胞的增殖反應(yīng),FAK還通過"Crosstalk"與生長因子受體通路相互作用,共同影響細胞的增殖。我們前期的研究結(jié)果顯示,門靜脈血流力學(xué)變化與FAK的表達以及肝再生之間存在密切的關(guān)系,血流力學(xué)可能通過FAK介導(dǎo)“細胞外基質(zhì)配體-整合素-細胞骨架”的信號通路來調(diào)節(jié)肝細胞的增殖。在此前提下,改變細胞生存的力學(xué)環(huán)境,是否改變肝細胞增殖的動力學(xué)尚不清楚。同樣在力學(xué)作用下,肝細胞的增殖反應(yīng)是否發(fā)生了相應(yīng)信號分子表達的變化尚不清楚。本課題擬就力學(xué)作用下肝細胞的增殖反應(yīng)和相關(guān)力學(xué)信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)作用進行研究。研究目的本實驗分為兩個部分：第一部分切應(yīng)力對肝細胞增殖的影響：以永生化大鼠3RL-3A肝細胞株為研究對象,加載不同大小的流體切應(yīng)力(Odyn/cm2-30 dyn/cm2),通過對細胞增殖動力學(xué)的觀察來研究流體切應(yīng)力對肝細胞增殖的影響。第二部分切應(yīng)力通過活化Ras/MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白ERK1/2促進肝細胞增殖的研究：以永生化大鼠BRL-3A肝細胞株為研究對象,在加載一定大小的切應(yīng)力下,同時用ERK1/2抑制劑抑制Ras/MAPK信號通路,通過觀察細胞的增殖情況及檢測Cyclin D蛋白表達水平及基因表達水平,來研究在肝細胞增殖過程中切應(yīng)力與Ras/MAPK信號通路的關(guān)系。研究方法(一)流體切應(yīng)力對肝細胞增殖影響的研究：1.研究對象：永生化大鼠BRL-3A肝細胞株；2.細胞的培養(yǎng)及流體切應(yīng)力的加載；3.實驗分組：1)對照組(B0組)：不予記載切應(yīng)(B-Odyn/cm2)；2)加12 dyn/cm2組(B12組)：對培養(yǎng)的細胞施加12 dyn/cm2切應(yīng)力(B-12dyn/cm2)；3)加24 dyn/cm2組(B24組)：對培養(yǎng)的細胞施加24 dyn/cm2切應(yīng)力(B-24dyn/cm2)；4.采用直接細胞計數(shù)和CCK-8檢測細胞增殖情況。5.對實驗結(jié)果進行t檢驗統(tǒng)計學(xué)分析。(二)切應(yīng)力通過活化Ras/MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白ERK1/2促進肝細胞增殖的研究研究對象：永生化大鼠BRL-3A肝細胞株；1.ERK1/2的特異性抑制劑PD98059處理干預(yù)組細胞2.細胞的培養(yǎng)及流體切應(yīng)力的加載；3.實驗分組：1)對照組：將細胞玻片置入流體應(yīng)力加載系統(tǒng)相同時間但不對其加力,也不給予抑制劑處理；2)單純加壓組：僅給細胞分別加載24dyn/cm2大小的流體切應(yīng)力；3)干預(yù)組：在給細胞加載24dyn/cm2大小的流體切應(yīng)力的同時在預(yù)先用ERK1/2蛋白抑制劑PD98059處理；4. 采用直接細胞計數(shù)和CCK-8檢測細胞增殖情況；5. Western印跡分析和熒光定量PCR檢測；6.對實驗結(jié)果進行t檢驗統(tǒng)計學(xué)分析。實驗結(jié)果(一)流體切應(yīng)力對肝細胞增殖影響的研究1.永生化大鼠BRL-3A肝細胞直接細胞計數(shù)結(jié)果：1)對照組(B0組)：0-168小時區(qū)間對照組細胞數(shù)呈加趨勢,于0-24小時內(nèi)增加最快。2)加12 dyn/cm2組(B12組)：0-24小時區(qū)間B12組細胞數(shù)呈增加趨勢,于24小時達到增殖高峰,并于24-168小時細胞增殖速率下降。3)加24 dyn/cm2組(B24組)：0-24小時區(qū)間B24組細胞呈增加趨勢,于24小時達到增殖高峰,并于24-168小時細胞增殖速率下降。4)加12 dyn/cm2組(B12組)與對照組(B0組)：同一時間位點,B12組細胞數(shù)明顯大于B12組細胞數(shù)(P0.05)。5)加24dyn/cm2組(B24組)與對照組(Bo組)：同一時間位點,B24組細胞數(shù)明顯大于B0組細胞數(shù)(P0.05)。6)加12 dyn/cm2組(B12組)與加24 dyn/cm2組(B24組)：同一時間位點,B24組細胞數(shù)明顯大于B12組細胞數(shù)(P0.05)。2.永生化大鼠BRL-3A肝細胞CCK-8吸光度值檢測結(jié)果：1)對照組(B0組)：0-168小時區(qū)間對照組細胞呈增殖趨勢,于0-24小時內(nèi)增加最快。2)加12 dyn/cm2組(B12組)：0-24小時區(qū)間B12組細胞吸光度值呈加趨勢,于24h達到高峰,并于24-168h出現(xiàn)吸光度值下降。3)加24 dyn/cm2組(B24組)：0-24小時區(qū)間B24組細胞吸光度值呈加趨勢,于24h達到高峰,并于24-168h出現(xiàn)吸光度下降。4)加12 dyn/cm2組(B12組)與對照組(Bo組)：同一時間位點,B12組細胞吸光度值明顯大于B0組細胞吸光度值(P0.05)。.5)加24 dyn/cm2組(B24組)與對照組(Bo組)：同一時間位點,B24組細胞吸光度值明顯大于B0組細胞吸光度值(P0.05)。6)加12 dyn/cm2組(B12組)與加24 dyn/cm2組(B24組)：同一時間位點,B24組細胞吸光度值明顯大于B12組細胞吸光度值(P0.05)。(二)切應(yīng)力通過活化Ras/MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白ERK1/2促進肝細胞增殖的研究1.永生化大鼠BRL-3A肝細胞直接顯微鏡下細胞計數(shù)結(jié)果：1)對照組(A組)：0-168小時區(qū)間A組細胞數(shù)呈增加趨勢,于0-24小時內(nèi)增殖最快。2)加壓組(B組)：0-24小時區(qū)間B組細胞數(shù)呈增加趨勢,于24小時達到增殖高峰,并于24-168小時細胞增殖速率下降。3)干預(yù)組(C組)：0-24小時區(qū)間C組細胞數(shù)呈增加趨勢,于24小時達到增殖高峰,并于24-168小時出現(xiàn)細胞增殖速率下降。4)加壓組(B組)組與對照組(A組)：同一時間位點,B組細胞數(shù)明顯大于A組細胞數(shù)(P0.05)。5)加壓組(B組)組與干預(yù)組(C組)：同一時間位點,B組細胞數(shù)明顯大于C組細胞數(shù)(P0.05)。6)干預(yù)組(C組)與對照組(A組)：同一時間位點,C組細胞數(shù)略大于A組細胞數(shù)(P0.05)。2.永生化大鼠BRL-3A肝細胞CCK-8吸光度值檢測結(jié)果：1)對照組(A組)：0-168小時區(qū)間A組吸光度呈增加趨勢,于0-24小時內(nèi)增加最快。2)加壓組(B組)：0-24小時區(qū)間B組吸光度呈增加趨勢,于24小時達到高峰,并于24-168小時出現(xiàn)下降。3)干預(yù)組(C組)：0-24小時區(qū)間C組吸光度呈增加趨勢,于24小時達到高峰,并于24-168小時出現(xiàn)下降。4)加壓組(B組)組與對照組(A組)：同一時間位點,B組吸光度明顯大于A組吸光度值(P0.05)。5)加壓組(B組)組與干預(yù)組(C組)：同一時間位點,B組吸光度明顯大于C組吸光度值(P0.05)。6)干預(yù)組(C組)與對照組(A組)：同一時間位點,C組細胞吸光度大于A組吸光度值(P0.05)3. Westen blot檢測永生化大鼠BRL-3A肝細胞ERK1/2的蛋白表達水平：1)加壓組(B組)組與對照組(A組)：在24小時時,B組Cyclin D1與β-Actin蛋白條帶灰度值的比值明顯大于A組(P0.05)。2)加壓組(B組)組與干預(yù)組(C組)：在24小時時,B組Cyclin D1與 β-Actin蛋白條帶灰度值的比值明顯大于C組(P0.05)。3)干預(yù)組(C組)與對照組(A組)：在24小時時,C組Cyclin D1與β-Actin蛋白條帶灰度值的比值大于A組(P0.05)。4.PCR檢測永生化大鼠BRL-3A肝細胞ERK1/2的基因水平表達的：1)加壓組(B組)與對照組(A組)：在24小時時,B組mRNA表達量明顯大于A組(P0.05)。2)加壓組(B組)與干預(yù)組(C組)：在24小時時,B組mRNA表達量明顯大于C組(P0.05)。3)干預(yù)組(C組)與對照組(A組)：在24小時時,C組mRNA表達量大于A組(P0.05)。全文結(jié)論(一)永生化大鼠]3RL-3A肝細胞株,加載切應(yīng)力組肝細胞增殖明顯大于對照組；加載切應(yīng)力大組增殖明顯大于加載切應(yīng)力小組和對照組。說明切應(yīng)力對永生化大鼠BRL-3A肝細胞株的增殖有促進作用；在生理可承受范圍內(nèi)(0dyn/cm2-30 dyn/cm2)受切應(yīng)力大者增殖速率明顯大于受切應(yīng)力小者。(二)永生化大鼠BRL-3A肝細胞株,抑制Ras/MAPK信號通路能降低切應(yīng)力促進肝細胞增殖的速度；但不能完全抑制切應(yīng)力對肝細胞增殖的促進作用。說明切應(yīng)力促進肝細胞增殖與激活Ras/MAPK信號通路有關(guān)；Ras/MAPK信號通路并非切應(yīng)力促進肝細胞增殖的唯一通路。
[Abstract]:The research background liver is involved in many important physiological activities of human body ( metabolism , detoxification , immune phagocytosis , etc . ) . The liver cell is the structural basis for the completion of these physiological activities . The liver regeneration ability is very strong . It is very important to explore the mechanism of liver regeneration .
In this study , the effects of fluid shear stress on the proliferation of hepatocytes were studied .
2 . the culture of cells and the loading of fluid shear stress ;
3 . Experimental group : 1 ) Control group ( B0 group ) : no recording should be recorded ( B - OVF / cm2 ) ;
( 2 ) Group B12 / cm2 ( B12 group ) : Apply a tensile stress ( B - 12hr / cm2 ) to the cultured cells ;
3 ) Twenty - four ( 24 / cm2 ) groups were added to the cultured cells ( group B24 ) , and the cultured cells were subjected to a shear stress ( B & # x2212 ; 24 & # x2212 ; 24 & # xb7 ; cm2 ) ;
4 . Direct cell count and CCK - 8 were used to detect cell proliferation .
1 . The specific inhibitor PD98059 was used to treat the cell 2 in the intervention group , and the cell culture and the fluid shear stress were loaded .
3 . Experimental group : 1 ) Control group : the cells were placed in fluid stress loading system at the same time without exerting force on it nor administered inhibitor ;
2 ) simple pressurizing group : only the cells were loaded with the fluid shear stress of 24 & lt ; 2 & gt ; / cm & lt ; 2 & gt ; respectively ;
3 ) Intervention group : PD98059 treatment was performed in advance while the cell was loaded with a fluid shear stress of 24 & lt ; 2 & gt ; / cm & lt ; 2 & gt ; .
4 . Direct cell count and CCK - 8 were used to detect cell proliferation .
5 . Western blot analysis and fluorescence quantitative PCR detection ;
The results were as follows : ( 1 ) The number of cells in group B 24 increased rapidly after 24 hours . The number of cells in group B 24 was significantly higher than that in control group ( P0.05 ) . At the same time , the absorbance of B24 group was significantly higher than that in group B ( group B 24 ) : the same time , the absorbance of B24 group was significantly higher than that in B12 group ( P0.05 ) . ( group C ) : The number of cells in group B was significantly higher than that in group A ( P 0.05 ) . The number of cells in group B was significantly higher than that in group A ( P0.05 ) . The expression levels of Cyclin D1 and 尾 - Actin in group B were significantly higher than those in group A ( P0.05 ) .
The effect of shear stress on the proliferation and proliferation was observed in the rat model , which was significantly larger than that of the loading and cutting stress group and the control group .
( 2 ) The inhibition of Ras / MAPK signaling pathway can reduce the shear stress and promote the proliferation of hepatocytes .
However , it is not possible to completely inhibit the effect of shear stress on the proliferation of hepatocytes . It is indicated that the stress - promoting cell proliferation is related to the activation of Ras / MAPK signaling pathway .
Ras / MAPK signaling pathway is not the only way to promote the proliferation of hepatocytes .

【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R657.3

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