本文選題：EGFR + LPS��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2015年碩士論文

【摘要】：內(nèi)毒素血癥主要是由革蘭氏陰性細菌感染引起,革蘭氏陰性細菌通過增殖、釋放內(nèi)毒素,從而引起組織損傷,甚至造成多器官功能障礙綜合癥。到目前為止,內(nèi)毒素血癥依然是重癥監(jiān)護病房中造成病人死亡的主要原因之一。但是,與其他感染性疾病不同,對于內(nèi)毒素血癥的治療并非特異性的,僅限于器官功能支持治療和通過輸液、抗感染和吸氧等。因此,對于內(nèi)毒素血癥的發(fā)病機制研究,為其治療提供理論依據(jù)和治療策略顯得非常重要。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁外層的主要結(jié)構,是一個含大量脂質(zhì)和多糖的結(jié)構。脂多糖通過與其天然免疫模式識別受體Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)結(jié)合后,脂多糖能夠促使大量的炎癥因子釋放,如腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)等。研究認為,LPS介導TNF-α生成的主要經(jīng)典信號通路是LPS通過TLR4/MAPKs/NF-κB/TNF-α信號通路。最近幾年的研究發(fā)現(xiàn),LPS能夠轉(zhuǎn)激活表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor, EGFR)。表皮生長因子受體屬于受體酪氨酸激酶家族,在體內(nèi)大部分細胞中都有表達,而且表皮生長因子受體EGFR在細胞增殖、分化和腫瘤生長等方面起到非常重要的作用。研究表明,在慢性氣道疾病中,LPS引起的氣道炎癥過程中可以使炎癥因子,例如IL-1, IL-6等,而LPS刺激炎癥因子的作用依賴于對EGFR的激活。同時,Kuper C及其同事們在對腎臟集合管細胞的研究中發(fā)現(xiàn),LPS轉(zhuǎn)激活EGFR需要通過TNF-α轉(zhuǎn)化酶(TNF-a-converting enzyme, TACE),最終會引起環(huán)氧酶2(cyclooxygenase2, COX2)產(chǎn)生。目前的這些研究表明,在LPS引起的內(nèi)毒素血癥中,EGFR的激活可能也會起到重要作用。在內(nèi)毒素血癥中,過量釋放炎癥介質(zhì)使內(nèi)毒素血癥患者發(fā)展為多器官功能衰竭存在更高的風險,也是內(nèi)毒素血癥患者高死亡率的重要原因。相關研究發(fā)現(xiàn)前炎癥因子TNF-α是造成內(nèi)毒素血癥心肌損傷的主要因素,而心肌細胞也是產(chǎn)生TNF-α的主要場所。β-arrestins作為一種銜接蛋白,在G蛋白復合物受體(G protein-coupled receptor,GPCR)脫敏中起到重要作用,同時β-arrestins在調(diào)控TLR信號通路和前炎癥因子基因表達中也起到重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)膜相關的GPCR/α-arrestins/c-Src復合物可以轉(zhuǎn)激活EGFR,然后進一步激活下游信號通路,如PI3K/Akt和Ras/Raf/MAPK/ERK信號通路,最后引起分化和增殖。目前沒有關于EGFR對于調(diào)控內(nèi)毒素血癥中心肌TNF-α生成的相關研究,同樣對于在炎癥中起到重要調(diào)節(jié)作用的β-arrestin 2有沒有參與LPS轉(zhuǎn)激活EGFR也沒有相關報道。本實驗,通過培養(yǎng)原代心肌細胞以及在野生型C57BL/6小鼠和β-arrestin 2基因敲除C57BL/6小鼠上,從細胞水平和在體水平,探討轉(zhuǎn)激活EGFR是否能夠?qū)?nèi)毒素血癥中心肌組織或心肌細胞產(chǎn)生TNF-α有影響,另外P-arrestin 2是否也會對LPS轉(zhuǎn)激活EGFR起到作用。材料和方法1.動物準備與模型制備SPF級C57BL/6雄性小鼠,6-8周齡,體重22-25g,購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心。β-arrestin2基因敲除小鼠購于Jackson實驗室后在南方醫(yī)院動物中心進行繁殖。小鼠飼養(yǎng)在南方醫(yī)院實驗動物中心：條件：室溫25-27℃,濕度50%-70%,5只/籠,自由攝取食物和水,早晚定時進行燈光變換,避免強光、噪音刺激。本實驗通過腹腔注射LPS (5mg/kg)制成內(nèi)毒素模型小鼠。2.原代心肌細胞培養(yǎng)使用D-Hanks稀釋的高純度膠原酶Liberase TH (Roche, Cat.# 11988468)稀釋到22.5μg/ml用于消化心臟組織。將新生小鼠心臟置于10ml無菌離心管中剪碎,用D-Hanks液平衡、清洗兩次后,于22.5μg/ml的Liberase TH中37℃預消化10 min,棄上清。再加入3ml左右的Liberase TH于37℃消化15min,每隔2min左右輕柔震蕩一次。收集上清,800×g,5min離心得到心肌細胞,使用M199+10%胎牛血清+1%青鏈霉素重懸細胞。另外將剩下的心臟組織再次加入3m1左右的Liberase TH于37℃消化15min,用同樣的方法離心、重懸心肌細胞(必要時,還可以將剩下的心臟組織進行第三次消化)。將兩次得到的心肌細胞混合在一起并預種植于10cm細胞培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)45-60min。隨后使用移液器輕柔吹洗細胞,并過濾于50m1離心管中,取101μl計數(shù),按照每孔50×104的密度,接種于24孔板中(24孔板預先使用1%的明膠封板1h,隨后吸棄明膠,并于室溫中干燥后使用),在M199+10%胎牛血清+1%青鏈霉素中培養(yǎng)24h后實驗。3.實驗過程3.1 PD168393和厄洛替尼對LPS轉(zhuǎn)激活EGFR的影響首先,在體外培養(yǎng)原代心肌細胞,原代心肌細胞分為6組：對照組：原代心肌細胞中加入鹽水；PD168393組：原代心肌細胞中加入PD168393使其終濃度為50μM；厄洛替尼組：原代心肌細胞中加入厄洛替尼使其終濃度為20μM；LPS組：原代心肌細胞中加入濃度為4μg/ml的LPS；LPS+PD168393組：原代心肌細胞中先加入終濃度為50μM的PD168393,0.5小時后加入濃度為4μg/ml的LPS；LPS+厄洛替尼組：原代心肌細胞中先加入終濃度為20μM的厄洛替尼,0.5小時后加入濃度為4μg/ml的LPS。經(jīng)過上述處理后,于0.5小時后收集細胞,用western blot的方法檢測磷酸化的EGFR和EGFR情況。其次,進行在體實驗研究。16只野生型C57BL/6小鼠隨機分為對照組、厄洛替尼組、LPS組和LPS+厄洛替尼組,每組4只。對照組：腹腔注射生理鹽水；厄洛替尼組：厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天；LPS組：腹腔注射LPS (5mg/kg);LPS+厄洛替尼組：厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天,第4天腹腔注射LPS(5mg/kg)。各組小鼠于LPS處理1小時后取心臟組織進行western blot檢測磷酸化EGFR和EGFR的情況。3.2研究抑制EGFR磷酸化對LPS介導的TNF-α生成是否有影響首先,在體外培養(yǎng)原代心肌細胞,原代心肌細胞分為9組：對照組：原代心肌細胞中加入鹽水；厄洛替尼20μM組：原代心肌細胞中加入厄洛替尼使其終濃度為20μM；PD16839350nM組：原代心肌細胞中加入PD168393使其終濃度為50μM；LPS組：原代心肌細胞中加入濃度為4μg/ml的LPS；LPS+PD168393組：原代心肌細胞中加入PD168393使其終濃度為2μM預處理30min后加入濃度為4μg/ml的LPS；LPS+PD168393 10μM組：原代心肌細胞中加入PD168393使其終濃度為10μM預處理30min后加入濃度為4μg/ml的LPS；LPS+PD168393組：原代心肌細胞中加入PD168393使其終濃度為50μM預處理30min后加入濃度為4μg/ml的LPS；LPS+厄洛替尼10μM組：原代心肌細胞中加入厄洛替尼使其終濃度為10μM預處理30min后加入濃度為4μg/ml的LPS；LPS+厄洛替尼20μM組：原代心肌細胞中加入厄洛替尼使其終濃度為20μM預處理30min后加入濃度為4μg/ml的LPS；各組分別于LPS處理后4小時用RT-PCR的方法檢測TNF-α的mRNA水平,用ELISA的方法檢測培養(yǎng)液中TNF-α的蛋白水平。其次,我們進行了在體實驗,16只野生型C57BL/6小鼠隨機分為對照組、厄洛替尼組、LPS組和LPS+厄洛替尼組,每組4只。對照組：腹腔注射生理鹽水；厄洛替尼組：厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天；LPS組：腹腔注射LPS (5mg/kg);LPS+厄洛替尼組：厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天,第4天腹腔注射LPS(5mg/kg)。各組小鼠于LPS處理6小時后取心臟組織進行ELISA法檢測TNF-α的蛋白水平。3.3 LPS轉(zhuǎn)激活EGFR后調(diào)控磷酸化的ERK1/2和p38的研究按照上述方法分離、培養(yǎng)原代心肌細胞。原代心肌細胞分為6組：對照組：原代心肌細胞加入鹽水；厄洛替尼組：原代心肌細胞中加入終濃度為20μM的厄洛替尼；PD168393組：原代心肌細胞中加入終濃度為50μM的PD168393；LPS組：原代心肌細胞濃度為4μg/ml的LPS；LPS+厄洛替尼組：原代心肌細胞中加入厄洛替尼使其終濃度為20μM預處理30min后加入濃度為4μg/ml的LPS；LPS+PD168393組：原代心肌細胞中加入PD168393使其終濃度為50μM預處理30min后加入濃度為4μg/ml的LPS；LPS處理后1.5小時收集細胞,用western blot的方法檢測磷酸化p38,磷酸化ERK1/2的情況。其次,我們進行了體內(nèi)實驗。16只野生型C57BL/6小鼠隨機分為對照組、厄洛替尼組、LPS組和LPS+厄洛替尼組,每組4只。厄洛替尼組和LPS+厄洛替尼組首先于每日上午8：00至11：30通過灌胃方式給予厄洛替尼(45mg/kg),連續(xù)灌胃3天。對照組和LPS組不做此處理。隨后第四天,對照組給予腹腔注射生理鹽水處理,LPS組和LPS+厄洛替尼組于腹腔注射LPS (5mg/kg)。對照組：腹腔注射生理鹽水；厄洛替尼組：厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天；LPS組：腹腔注射LPS (5mg/kg);LPS+厄洛替尼組：厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天,第4天腹腔注射LPS(5mg/kg)。各組小鼠于LPS處理2小時后取心臟組織進行western blot法檢測磷酸化ERK1/2,磷酸化p38水平。304.研究β-arrestin 2對LPS介導心肌細胞合成TNF-α的影響為了研究P-arrestin 2在LPS介導的TNF-α的合成中的作用,我們應用β-arrestin 2基因敲除小鼠進行研究。實驗分組和操作步驟如下：對照組：野生型C57BL/6小鼠,腹腔注射生理鹽水；β-arrestin 2+-/-組：β-arrestin 2基因敲除雜合子小鼠,腹腔注射生理鹽水；β-rrestin 2-/-組：β-arrestin 2基因敲除純合子小鼠,腹腔注射生理鹽水；LPS組：野生型C57BL/6小鼠,腹腔注射LPS (5mg/kg);LPS+β-arrestin 2+/-組：β-arrestin 2基因敲除雜合子小鼠,腹腔注射LPS(5mg/kg);LPS+β-arrestin 2-/-組：β-arrestin 2基因敲除純合子小鼠,腹腔注射LPS(5mg/kg);各組小鼠于LPS處理后6小時取心臟組織用RT-PCR和ELISA的方法檢測TNF-α蛋白水平。3.5.研究β-arrestin 2對轉(zhuǎn)激活EGFR的作用如果β-arrestin 2和EGFR都會對心臟組織合成TNF-α起到作用,那么β-arrestin 2是否也參與LPS介導的轉(zhuǎn)激活EGFR?我們進行了以下研究：對照組：野生型C57BL/6小鼠,腹腔注射生理鹽水；β-arrestin 2+/組：β-arrestin 2基因敲除雜合子小鼠,腹腔注射生理鹽水；β-arrestin 2-/-組：β-arrestin 2基因敲除純合子小鼠,腹腔注射生理鹽水；LPS組：野生型C57BL/6小鼠,腹腔注射LPS(5mg/kg)；LPS+β-arrestin 2+/-組:β-arrestin 2基因敲除雜合子小鼠,腹腔注射LPS(5mg/kg)；LPS+β-arrestin 2-/-組：β-arrestin 2基因敲除純合子小鼠,腹腔注射LPS(5mg/kg)；LPS處理后1小時、2小時取心臟組織,用western blot的方法檢測磷酸化EGFR(1小時),磷酸化p38及磷酸化ERK1/2(2小時)的水平。3.6研究抑制EGFR磷酸化對于小鼠心功能的影響C57BL/6小鼠分為對照組、厄洛替尼組、LPS組、LPS+厄洛替尼組,通過超聲心動圖檢查小鼠心功能。對照組：野生型C57BL/6小鼠,腹腔注射生理鹽水；厄洛替尼組：野生型C57BL/6小鼠,厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天；LPS組：野生型C57BL/6小鼠,腹腔注射LPS(5mg/kg);LPS+厄洛替尼組：野生型C57BL/6小鼠,厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天,第4天腹腔注射LPS(5mg/kg)。LPS處理后6小時進行小鼠超聲心動圖檢查小鼠心率、心輸出量、射血分數(shù)、左室短軸縮短率和每搏量變化。3.7.EGFR抑制劑厄洛替尼對內(nèi)毒素血癥小鼠生存率的影響C57BL/6小鼠隨機分為對照組、厄洛替尼組、LPS組和LPS+厄洛替尼組。對照組：腹腔注射生理鹽水；厄洛替尼組：厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天；LPS組：腹腔注射LPS(5mg/kg);LPS+厄洛替尼組：厄洛替尼(45mg/kg)灌胃3天,第4天腹腔注射LPS(5mg/kg)。給予正常飲食和水,觀察3天后小鼠的生存情況。結(jié)果1.PD168393和厄洛替尼可以有效抑制LPS介導的EGFR磷酸化我們發(fā)現(xiàn)在體外實驗中,原代心肌細胞中給予LPS(4μg/ml)處理0.5小時后可以轉(zhuǎn)激活EGFR,而給予PD168393(50μM)或厄洛替尼(20μM)預處理后可以抑制EGFR的激活((p0.05))。進一步我們在體內(nèi)實驗中,同樣觀察到LPS刺激后可以轉(zhuǎn)激活EGFR,而在厄洛替尼預處理組可以抑制EGFR的轉(zhuǎn)激活((p0.05))。說明在體內(nèi)和體外,LPS可介導心肌細胞EGFR激活,且LPS介導的EGFR激活可以部分被EGFR可逆性抑制劑厄洛替尼和非可逆性抑制劑PD168393所拮抗。2.抑制EGFR磷酸化可以降低LPS介導的TNF-α的合成我們在體外培養(yǎng)原代心肌細胞,并分別給予不同濃度的特異性EGFR磷酸化抑制劑PD168393(非可逆性)或者厄洛替尼(可逆性)預處理30min,我們發(fā)現(xiàn)LPS刺激后,TNF-α的mRNA和蛋白合成顯著增加,而預先給予PD168393或厄洛替尼處理30min的原代心肌細胞與LPS組相比,可以顯著降低TNF-α的mRNA和蛋白水平(p0.05)。而隨著抑制劑濃度的提高,對于TNF-α的mRNA和蛋白合成的抑制作用也相應增加。而在體內(nèi)實驗中,我們同樣發(fā)現(xiàn)與LPS組相比,預先給予抑制劑處理的小鼠心肌細胞中的TNF-α的mRNA和蛋白合成是顯著下降的(p0.05)。3.LPS轉(zhuǎn)激活EGFR調(diào)控ERK1/2和p38的磷酸化我們在體外實驗中檢測原代心肌細胞在LPS、PD168393、厄洛替尼不同處理后的ERK1/2和p38磷酸化水平,我們發(fā)現(xiàn)在體外實驗中,LPS刺激原代心肌細胞1小時后可以觀察到ERK1/2和p38的磷酸化,而預先給予PD168393或厄洛替尼處理的心肌細胞再接受LPS刺激時,LPS刺激引起的ERK1/2和p38磷酸化水平下降了。相應的在體內(nèi)實驗中,LPS刺激后,小鼠心臟組織出現(xiàn)ERK1/2和p38磷酸化,而預先給予抑制劑厄洛替尼后,我們發(fā)現(xiàn)LPS刺激引起的ERK1/2和p38磷酸化被抑制了。這充分說明ERK1/2和p38參與了LPS介導的心肌細胞TNF-α的產(chǎn)生。4.β-arrestin 2能夠調(diào)節(jié)LPS介導的心肌組織TNF-α的合成在LPS引起的內(nèi)毒素血癥中,我們發(fā)現(xiàn)β-arrestin 2基因敲除小鼠與野生型小鼠相比,心肌組織中TNF-α的合成是下降的(p0.05)。而基因敲除的純合子與雜合子相比,心肌組織中TNF-α的水平下降的更明顯。這說明β-arrestin 2參與調(diào)節(jié)LPS介導的心肌組織中TNF-α的合成。5.LPS轉(zhuǎn)激活EGFR需要β-arrestin 2我們采用野生型C57BL/6小鼠、β-arrestin 2基因敲除C57BL/6小鼠制成內(nèi)毒素血癥模型進行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),LPS刺激后,β-arrestin 2基因敲除組小鼠與野生型組小鼠相比,磷酸化的EGFR水平下降了,同樣的β-arrestin 2基因敲除后,下游信號分子磷酸化ERK1/2和磷酸化p38的水平是下降的這說明在LPS轉(zhuǎn)激活EGFR和下游信號通路的過程中是非常重要的。6.抑制EGFR磷酸化顯著減輕內(nèi)毒素小鼠的心功能損害小鼠超聲心動圖結(jié)果顯示C57BL/6小鼠厄洛替尼灌胃3天處理組與對照組相比,心輸出量、左室射血分數(shù)、左室縮短分數(shù)和每搏量顯著升高(p0.05)。這說明抑制EGFR磷酸化能夠顯著提高左室射血功能,減輕LPS所致的心功能損害。7.抑制EGFR的激活可以提高LPS介導的內(nèi)毒素野生型C57BL/6小鼠的生存率通過不同分組處理C57BL/6小鼠,發(fā)現(xiàn)LPS處理24小時后,觀察到鹽水對照組大約48%小鼠死亡,而厄洛替尼預處理組小鼠的死亡率大約為32%,72小時后,厄洛替尼預處理組生存率為52%,與LPS處理組(生存率大約只有16%)是顯著提高的,說明預先給予EGFR抑制劑抑制EGFR的磷酸化能夠顯著提高內(nèi)毒素小鼠的生存率(p0.05)。結(jié)論我們的研究證明,在內(nèi)毒素血癥中,LPS轉(zhuǎn)激活EGFR對調(diào)節(jié)心臟來源的TNF-α的mRNA和蛋白水平起到重要作用。通過使用EGFR抑制劑PD168393或者厄洛替尼抑制EGFR的磷酸化,可以降低LPS刺激引起的p38和ERK1/2的磷酸化。LPS刺激后β-arrestin 2基因敲除組小鼠,與對照組相比磷酸化EGFR及其下游信號通路中的p38和ERK1/2的磷酸化是下降的,說明LPS轉(zhuǎn)激活EGFR需要β-arrestin 2參與。厄洛替尼抑制內(nèi)毒素血癥小鼠心肌的EGFR激活能夠有效改善左心室射血功能和改善心功能障礙,提高小鼠生存率。這些結(jié)果提供了EGFR在內(nèi)毒素血癥心肌TNF-α生成之間的聯(lián)系,也為臨床治療內(nèi)毒素血癥提供新的方向。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R614

【共引文獻】

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本文編號：1776469