本文選題：TLR4 + 靜脈移植�。� 參考：《吉林大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目的： 構(gòu)建TLR4siRNA重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染大鼠旁路移植靜脈，研究TLR4在移植靜脈內(nèi)膜增生過程中的調(diào)節(jié)作用。探討TLR4對炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-a、抑制粘附分子ICAM-1、VCAM-1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，并研究沉默TLR4基因?qū)rx1過表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲、遷移和增殖能力的影響。 方法： 建立SD大鼠頸動脈旁路移植模型，450只大鼠隨機(jī)分為五組：空白對照組；陰性對照組；TLR4siRNA溶液灌注組；TLR4siRNA蛋白膠組；TLR4siRNA溶液灌注+TLR4siRNA蛋白膠組。分別于術(shù)后1、3、7、14及28天獲取移植靜脈，每個時間點(diǎn)18只。為了揭示TLR4在靜脈移植內(nèi)膜增生過程中是否參與調(diào)節(jié)作用，我們用Real-time PCR檢測術(shù)后1、3、7天獲取的移植靜脈中TLR4及炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)水平。術(shù)后1、3、7、14及28天獲取移植靜脈行組織切片，HE染色測量內(nèi)膜厚度。 Western blot檢測大鼠移植靜脈組血管內(nèi)膜增生組Prx1的表達(dá)；逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染VSMC細(xì)胞，構(gòu)建Prx1穩(wěn)定高表達(dá)的VSMC細(xì)胞系。MTT實(shí)驗(yàn)檢測Prx1過表達(dá)對VSMC細(xì)胞增殖能力的影響；Transwell實(shí)驗(yàn)檢測Prx1過表達(dá)對VSMC細(xì)胞侵襲能力的影響；Wound-healing實(shí)驗(yàn)檢測Prx1過表達(dá)對VSMC細(xì)胞組遷移能力的影響。在Prx1過表達(dá)細(xì)胞組中同時轉(zhuǎn)染TLR4干擾質(zhì)粒，MTT實(shí)驗(yàn)檢測TLR4基因沉默對VSMC細(xì)胞增殖的影響；Wound-healing實(shí)驗(yàn)檢測TLR4基因沉默對VSMC細(xì)胞組遷移能力的影響。 結(jié)果： （1）隨著移植靜脈血管內(nèi)膜的增生、水腫，TLR4基因表達(dá)量顯著升高，并在移植的第3天達(dá)到高峰（p0.05,n=6），并與第7天，第14天相比，無明顯差異（p0.05,n=6）；（2）與正常靜脈相比，移植靜脈中的IL-1β、IL-6、TNF-a、ICAM-1、VCAM-1及TLR4mRNA基因表達(dá)水平在術(shù)后1周內(nèi)明顯升高。與對照組相比，TLR4siRNA溶液灌注組，TLR4siRNA蛋白膠組，TLR4siRNA溶液灌注+TLR4siRNA蛋白膠組炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNFα、ICAM-1、VCAM-1及TLR4基因表達(dá)水平在術(shù)后1、3、7天均顯著下降；（3）從TLR4siRNA溶液灌注組，TLR4siRNA蛋白膠組，TLR4siRNA溶液灌注+TLR4siRNA蛋白膠組的結(jié)果上看，TLR4siRNA的處理方法沒有影響TLR4siRNA對IL-1β、IL-6、TNF-a、ICAM-1、VCAM-1的基因表達(dá)的抑制作用。 Prx1在血管內(nèi)膜增生組中的表達(dá)明顯高于對照組。VSMC細(xì)胞Prx1過表達(dá)組細(xì)胞的穿膜數(shù)量為（150±17）/視野，明顯高于對照組的細(xì)胞穿膜數(shù)量（40±5）/視野。VSMC細(xì)胞Prx1過表達(dá)組細(xì)胞的遷移距離明顯高于對照組。Prx1過表達(dá)組的細(xì)胞存活數(shù)在第1、2、3天分別為（5.625±0.1）×105、（8.9±0.737）×105、（10.635±0.065）×105，顯著高于對照組細(xì)胞在第1、2、3天的細(xì)胞存活數(shù)（3.0±0.025）×105、（4.1±0.035）×105、（5.06±0.023）×105。說明Prx1過表達(dá)促進(jìn)了VSMC細(xì)胞的增殖能力。TLR4SiRNA干擾+Prx1過表達(dá)組的VSMC細(xì)胞遷移距離明顯低于Prx1過表達(dá)組細(xì)胞的遷移距離。TLR4SiRNA干擾+Prx1過表達(dá)組的細(xì)胞存活數(shù)在第1、2、3天分別為（3.824±0.43）×105、（5.395±0.6）×105、（6.456±0.28）×105，顯著低于Prx1過表達(dá)組在第1、2、3天的細(xì)胞存活數(shù)（5.825±0.12）×105、（9.1±0.5375）×105、（10.735±0.075）×105。 結(jié)論： 大鼠旁路靜脈移植術(shù)后，，出現(xiàn)明顯的急性炎癥反應(yīng)，內(nèi)膜增生明顯，TLR4及炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平顯著升高，參與負(fù)向調(diào)節(jié)作用。降低TLR4的表達(dá)能夠抑制移植靜脈內(nèi)膜增生，抑制炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-a的表達(dá)，抑制粘附分子ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)。 Prx1過表達(dá)促進(jìn)了VSMC的侵襲、遷移及增殖能力；沉默TLR4基因后能夠減弱Prx1過表達(dá)對VSMC的誘導(dǎo)作用，沉默TLR4基因顯著抑制了VSMC的侵襲、遷移和增殖能力。說明Prx1依賴于TLR4促進(jìn)VSMC的侵襲、遷移和增殖能力，TLR4有望成為血管內(nèi)膜增生診斷、治療及預(yù)后評估的新靶點(diǎn)。
[Abstract]:Objective:
To construct the recombinant plasmid of TLR4siRNA was transfected into rat vein graft bypass, the role of regulating TLR4 in the process of intimal hyperplasia of vein transplantation. To discuss the effects of TLR4 on inflammatory cytokines IL-1 beta, IL-6, TNF-a, inhibition of adhesion molecule ICAM-1, regulate the expression of VCAM-1, and to study the gene silence of TLR4 overexpression induced cell invasion of Prx1. Migration and proliferation.
Method:
The establishment of SD rat carotid artery bypass graft model, 450 rats were randomly divided into five groups: control group; negative control group; TLR4siRNA group TLR4siRNA solution perfusion; fibrin glue group; TLR4siRNA solution perfusion +TLR4siRNA fibrin glue group. Respectively after 1,3,7,14 and 28 days for vein graft, 18 rats at each time point in order to reveal whether TLR4 is involved in the regulation of action in the process of vein graft intimal hyperplasia, we use TLR4 and inflammatory cytokines IL-1 get 1,3,7 days Real-time PCR detection after transplantation in intravenous beta, IL-6, the expression level of TNF- alpha mRNA. Vein graft tissue sections for 1,3,7,14 and for 28 days after operation, HE staining to measure the intima the thickness.
The expression of Western blot was detected in the rat vein graft intimal hyperplasia group group Prx1; retrovirus transfected VSMC cell, VSMC cell line was established by.MTT assay, Prx1 high expression of stable Prx1 overexpression on the proliferation ability of VSMC cells; Transwell assay was used to detect the effect of overexpression of Prx1 on invasion of VSMC cells; Wound-healing assay Prx1 effect on the expression of VSMC cell migration ability. In the Prx1 overexpressing cell group and transfected with TLR4 plasmid, MTT assay to detect the effect of TLR4 gene silencing on the proliferation of VSMC cells; Wound-healing assay of TLR4 gene silencing on VSMC cells migration.
Result:
(1) with intimal hyperplasia of the transplanted vein, edema, TLR4 gene expression was significantly increased, and reached a peak in third days of transplantation (P0.05, n=6), and seventh days, fourteenth days compared with no significant difference (P0.05, n=6); (2) compared with the normal veins, veins of Yi Zhijing IL-6, TNF-a, IL-1 beta, ICAM-1, VCAM-1 and TLR4mRNA gene expression level in 1 weeks after surgery was significantly increased. Compared with the control group, TLR4siRNA solution perfusion group, TLR4siRNA protein gel group, TLR4siRNA solution perfusion +TLR4siRNA fibrin glue group of inflammatory cytokines IL-6, IL-1 beta, TNF alpha, ICAM-1, VCAM-1 and TLR4 gene expression the level at 1,3,7 days after operation were significantly decreased; (3) from TLR4siRNA solution perfusion group, TLR4siRNA glue group, TLR4siRNA solution perfusion +TLR4siRNA fibrin glue group results, the processing method of TLR4siRNA has no effect on IL-1 TLR4siRNA IL-6, TNF-a, beta, ICAM-1, inhibition of VCAM-1 gene expression The effect of the system.
The expression of Prx1 in intimal hyperplasia was significantly higher than the control group of.VSMC cells Prx1 expression of the number of transmembrane cells to the group (150 + 17) / vision, significantly higher than the control group in the cell membrane numbers (40 + 5) /.VSMC cell migration distance of vision over expression of Prx1 cells was significantly higher than the control group.Prx1 over expression group the number of survival cells on day 1,2,3 respectively (5.625 + 0.1) * 105 (8.9 + 0.737) * 105 (10.635 + 0.065) * 105, significantly higher than the control group cells on day 1,2,3 cell survival (3 + 0.025) * 105 (4.1 + 0.035) * 105, (5.06 + 0.023) * 105. indicated that overexpression of Prx1 promoted VSMC cell migration from the proliferation of.TLR4SiRNA +Prx1 cells overexpressing VSMC interference group was significantly lower than that in Prx1 cells the migration distance of.TLR4SiRNA interference in +Prx1 overexpression group the number of survival cells on day 1,2,3 respectively (3.824 + 0.43) * 105 (5.395 + 0.6). X 105, (6.456 + 0.28) * 105, significantly lower than the cell survival of Prx1 over expression group (5.825 + 0.12) x 105, (9.1 + 0.5375) x 105, (10.735 + 0.075) * 105.
Conclusion:
Rat vein bypass transplantation, acute inflammatory reaction obviously, endometrial hyperplasia significantly, the expression of TLR4 and inflammatory cytokines increased significantly in negative regulation. Reducing the expression of TLR4 can inhibit intimal hyperplasia of vein grafts, inhibition of inflammatory cytokine IL-1 beta, IL-6, TNF-a expression, inhibition of adhesion molecule ICAM-1, the expression of VCAM-1.
Overexpression of Prx1 promoted VSMC invasion, migration and proliferation; after silencing TLR4 gene can decrease Prx1 overexpression induced effect on VSMC, TLR4 gene silencing significantly inhibited VSMC invasion, migration and proliferation. Prx1 relies on TLR4 to promote VSMC invasion, migration and proliferation ability, TLR4 is expected to become a diagnosis of vascular intimal hyperplasia, a new target evaluation of treatment and prognosis.

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R654.2

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