本文選題：軟骨終板干細胞 + 凋亡�。� 參考：《第三軍醫(yī)大學》2017年碩士論文

【摘要】：一、研究背景椎間盤(Intervertebral disc,IVD)是人體重要的組織,由軟骨終板,髓核及纖維環(huán)三個部分組成。IVD隨著年齡的增長會發(fā)生不同程度的退變,繼發(fā)引起多種臨床疾病如椎管狹窄、椎間盤突出和脊柱節(jié)段不穩(wěn)等,給患者和社會造成極大的經濟和心理負擔。IVD退變是多種因素共同作用的結果,引起其發(fā)病的原因大致可分為遺傳因素、年齡因素、營養(yǎng)及生物力學因素等。在成年人體內,IVD是一種無血管的結締組織,其營養(yǎng)來源主要是依靠軟骨終板和纖維環(huán)的滲透作用。相關研究證實,營養(yǎng)剝奪能夠誘導軟骨終板細胞凋亡,進而導致軟骨終板退變,最終引起整個IVD退行性改變,并且在兔髓核細胞中,營養(yǎng)剝奪可通過上調BNIP3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-interacting protein 3)的表達誘導細胞凋亡進而引起IVD退變。然而營養(yǎng)剝奪誘導軟骨終板退變過程中的分子機制尚未闡明。因此,明確營養(yǎng)剝奪引起軟骨終板退變過程的分子機制對于防治IVD退變有重要的科學意義和社會價值。二、研究目的通過模擬椎體血供及椎體外周微循環(huán)受損的環(huán)境,在體外建立營養(yǎng)剝奪的細胞培養(yǎng)模型,研究營養(yǎng)剝奪對軟骨終板干細胞(cartilage endplate-derived stem cells,CESCs)的影響及BNIP3信號通路在其中的可能作用,從而進一步闡明IVD的退變機制。三、研究方法在臨床上獲取8例退變的椎間盤軟骨終板標本,從中分離提取終板的軟骨細胞,用纖維連結蛋白(Fibronectin,FN)篩選獲取CESCs,進行干細胞表面抗原標志物鑒定后擴大培養(yǎng),選取第三代的細胞進行實驗,其中對照組在正常培養(yǎng)條件下(DMEMF12、5m M葡萄糖、21%O2、10%血清)培養(yǎng),實驗組在營養(yǎng)剝奪條件(DMEMF12、無糖、1%O2、無血清)分別培養(yǎng)24 h和48 h。細胞處理后,應用流式細胞儀對細胞凋亡率進行檢測,實時熒光定量PCR和Western Blot分別檢測BNIP3基因和蛋白表達水平的變化,免疫熒光染色檢測BNIP3蛋白與CESCs線粒體的結合情況,JC-1染色法檢測線粒體膜電位(mitochondrial transmembrane potential,MMP)的變化,Caspase-3活性檢測試劑盒檢測Caspase-3酶的活性。進一步使用BNIP3 si RNA沉默CESCs中BNIP3基因表達,轉染24 h后將細胞分別在正常條件和營養(yǎng)剝奪條件下培養(yǎng)48 h,同時設置陰性干擾對照組(使用Scramble si RNA),再次對細胞凋亡率及BNIP3的表達情況進行檢測。四、研究結果1.細胞鑒定結果:使用纖維鏈接蛋白篩選獲取CESCs,并進行表面抗原標記物檢測,其中CD90、CD105、CD73和CD44為陽性,而Neg CKT(包含有HLA-DR、CD19、CD34、CD11b和CD45)為陰性,結果說明:CESCs具備干細胞的特性。2.細胞凋亡率及BNIP3表達的檢測結果:實驗組CESCs的凋亡率(24 h:24.47%±0.97%,48 h:28.98%±0.47%)顯著高于對照組(17.26%±1.84%,p0.05);BNIP3基因及蛋白表達水平實驗組顯著高于對照組(p0.05),結果說明:營養(yǎng)剝奪可上調BNIP3的表達,誘導CESCs的凋亡率增加。3.干擾BNIP3基因的表達后,再次檢測細胞凋亡率及BNIP3表達情況:干擾BNIP3表達的實驗組CESCs凋亡率(23.72%±1.21%)顯著低于對照si RNA實驗組(34.05%±1.43%,p0.05);干擾組與對照si RNA組相比,BNIP3蛋白表達明顯下調,結果說明:干擾BNIP3基因能夠部分抑制由營養(yǎng)剝奪所導致的細胞凋亡。4.免疫熒光的結果:營養(yǎng)剝奪能夠上調BNIP3蛋白的表達,并促進其與線粒體結合,導致線粒體膜電位下降。5.Caspase-3酶活性檢測:組間的Caspase-3酶活性無統(tǒng)計學意義(p0.05),結果說明:營養(yǎng)剝奪誘導細胞凋亡是通過Caspase-3非依賴性途徑發(fā)揮作用。五、結論營養(yǎng)剝奪通過上調CESCs中BNIP3基因和蛋白的表達水平,促進BNIP3蛋白與線粒體結合導致MMP下降,最終通過Caspase-3非依賴性途徑介導CESCs的凋亡。
[Abstract]:First, the research background of intervertebral disc (Intervertebral disc IVD) is an important organization of the human body, the cartilage endplate, nucleus pulposus and annulus of three parts of.IVD with age will occur in varying degrees of degeneration, secondary causes a variety of clinical conditions such as spinal stenosis, lumbar disc herniation and lumbar segmental instability, to patients and society caused great economic and psychological burden of.IVD degeneration is the result of many factors, the cause of the disease can be divided into genetic factors, age factors, nutrition and biomechanical factors. In adults, IVD is a kind of connective tissue, its nutrition is the main source of cartilage by osmosis endplate and annulus. Related research confirmed that nutritional deprivation can induce cartilage cell apoptosis, leading to cartilage endplate degeneration, causing the entire IVD degenerative changes in rabbit nucleus pulposus and fine The cell, nutrient deprivation upregulates BNIP3 (Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-interacting protein 3) expression induced apoptosis and cause IVD degeneration. However the molecular mechanism of nutrient deprivation induced cartilage endplate degeneration process has not been elucidated. Therefore, nutrient deprivation leads to clear molecular mechanism of cartilage endplate degeneration process has important scientific significance and social value for the prevention of IVD degeneration. Two, the purpose of the study by simulating the blood supply of vertebral body and the vertebral peripheral microcirculation damage to the environment, the establishment of nutrient deprivation cells in vitro model, study on nutrition deprivation of cartilage stem cells (cartilage endplate-derived stem cells, CESCs) and the effect of BNIP3 signaling pathway may play a role in them, and to further elucidate the mechanism of IVD degeneration. Three, intervertebral disc endplate cartilage specimens obtained from 8 patients with degenerative research methods in clinic, separated from Cartilage endplate extraction, with fibronectin (Fibronectin, FN) were CESCs, stem cell surface antigen markers after extended culture experiment selected third generation cells, the control group under normal culture conditions (DMEMF12,5m M glucose, serum 21%O2,10%) cultured in nutrient deprived conditions (experiment group DMEMF12, 1%O2, sugar free, no serum) were cultured for 24 h and 48 h. After treatment of cells, cell apoptosis was detected by flow cytometry, real-time fluorescence quantitative PCR and Western Blot were used to detect the BNIP3 gene and protein expression level changes, combined with immunofluorescence staining was used to detect the BNIP3 protein and mitochondrial CESCs detection of mitochondrial membrane, JC-1 staining potential (mitochondrial transmembrane potential, MMP) changes, the detection of Caspase-3 enzyme Caspase-3 activity detection kit using BNIP3 Si RNA further activity. The expression of BNIP3 silencing CESCs gene in 24 h after transfection, cells were in normal condition and nutrient deprivation cultivation under the condition of 48 h, and set the negative control group (Scramble Si interference RNA), were detected again on the apoptosis rate and BNIP3 expression. Four, the results of 1. cell identification results: screening for CESCs the use of fiber link protein, and surface antigen markers, including CD90, CD105, CD73 and CD44 were positive, while Neg CKT (including HLA-DR, CD19, CD34, CD11b and CD45) was negative. The results show that: the testing results of CESCs have the characteristics of.2. cell apoptosis rate and BNIP3 expression of stem cell. The apoptosis rate of CESCs group (24 h:24.47% h:28.98% + 0.97%, 48 + 0.47%) was significantly higher than the control group (17.26% + 1.84%, P0.05); BNIP3 gene and protein expression levels in the experimental group was significantly higher than the control group (P0.05). The results show that: nutrient deprivation upregulates BNIP3 The expression of apoptosis induced by CESCs expression increased after.3. interference of BNIP3 gene, again to detect the cell apoptosis rate and the expression of BNIP3 in experimental group: CESCs apoptosis interference BNIP3 expression rate (23.72% + 1.21%) was significantly lower than the control Si RNA experimental group (34.05% + 1.43%, P0.05); interference group compared with the control of Si RNA group, the expression of BNIP3 protein was down regulated, results show that the interference of BNIP3 gene can partially inhibit the apoptosis of.4. cells by immunofluorescence caused by nutrient deprivation results: nutrient deprivation can upregulate the expression of BNIP3 protein and promote its combination with mitochondria, decreased the mitochondrial membrane potential.5.Caspase-3 activity detection: Caspase-3 activity between groups no statistical significance (P0.05). The results showed that the nutrient deprivation induced apoptosis through Caspase-3 dependent pathway. Conclusion five, nutrient deprivation by BNIP3 upregulation of CESCs gene and egg The expression level of white, which promotes the binding of BNIP3 protein to mitochondria, leads to the decrease of MMP, and ultimately mediates the apoptosis of CESCs through the Caspase-3 non dependent pathway.

【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R681.5

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