本文選題：兔骨髓基質(zhì)干細胞 + 雙基因轉(zhuǎn)染�。� 參考：《西南醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：目的:(1)探索采用密度梯度離心法分離、貼壁法收集并體外培養(yǎng)兔骨髓基質(zhì)干細胞并將其作為組織工程骨種子細胞的方法(2)探索利用脂質(zhì)體介導BMP-2、VEGF-165雙基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔骨髓基質(zhì)干細胞的方法,明確經(jīng)BMP-2、VEGF-165共轉(zhuǎn)染后兔骨髓基質(zhì)干細胞的細胞增殖能力變化(3)明確BMP-2、VEGF-165基因在共同轉(zhuǎn)染兔骨髓基質(zhì)干細胞后表達過程中的相互影響及雙基因轉(zhuǎn)染兔骨髓基質(zhì)干細胞的體外成骨能力鑒定。方法:(1)提取健康新西蘭兔的股骨骨髓,利用密度梯度離心分離骨髓成分、體外培養(yǎng)及增殖兔骨髓基質(zhì)干細胞并鑒定。(2)利用Lipofect-amine2000脂質(zhì)體介導A組:p IRES-h BMP2-h VEGF165轉(zhuǎn)染組、B組:p IRES-h BMP2轉(zhuǎn)染組、C組:p IRES-h VEGF165轉(zhuǎn)染組、D組:空載體轉(zhuǎn)染組的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染兔骨髓基質(zhì)干細胞。熒光顯微鏡觀察前述各組以不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔骨髓基質(zhì)干細胞后的形態(tài)并以MTT法繪制生長曲線,根據(jù)MTT結(jié)果和轉(zhuǎn)染后熒光照片明確不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細胞的增殖能力變化。(3)通過酶聯(lián)免疫吸附法等方法明確各組在不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后BMP-2和VEGF-165基因的表達情況,以及根據(jù)對堿性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型骨膠原蛋白以及骨鈣素染色水平的檢測以比較其體外成骨能力與單基因轉(zhuǎn)染組的區(qū)別。結(jié)果:(1)兔骨髓基質(zhì)干細胞的形態(tài)變化:原代兔BMSCs分離的初始可見懸浮培養(yǎng)液中絕大多數(shù)的細胞為單個存在的較大體積圓形有核細胞,48小時后逐漸貼壁細胞變多,且部分細胞變?yōu)槿切�、逗號形或短棍�?可觀察到少許偽足形成;培養(yǎng)后6-10天時,許多貼壁細胞的體積逐漸變大,開始匯集形成集落并不斷增大,細胞形態(tài)開始向多角形以及細長形變化,胞內(nèi)變?yōu)?至2個細胞核;培養(yǎng)14天時培養(yǎng)瓶出現(xiàn)融合的單層細胞,大部分細胞的細胞核消失。傳代后的兔BMSCs細胞呈球形或橢圓樣,很快貼壁并重新變?yōu)樗笞有?待細胞完全貼壁及密度提高后,細胞形狀成為單一的梭形。經(jīng)過傳代后細胞的增殖速度較傳代前變快,傳代5到7天后細胞再次鋪滿培養(yǎng)瓶底,呈螺旋狀均勻分布。進一步行連續(xù)傳代后未見明顯的細胞形態(tài)變化�；蜣D(zhuǎn)染后的兔骨髓基質(zhì)干細胞仍為梭子形或多邊形,分裂增殖速度較轉(zhuǎn)染前有所降低。通過熒光顯微鏡觀察,轉(zhuǎn)染后24小時后各轉(zhuǎn)染組即可見少量綠色熒光,證明轉(zhuǎn)染成功,但轉(zhuǎn)染率尚低。轉(zhuǎn)染48-72小時后熒光逐漸增強,直至轉(zhuǎn)染4d后見熒光強烈發(fā)出。(2)轉(zhuǎn)染后MTT結(jié)果:各組細胞的OD值隨培養(yǎng)時間增加而逐漸增長,各細胞組之間和每個細胞組在各時間點間所測得的OD值增長情況無明顯統(tǒng)計學差異。P3代普通兔BMSCs細胞在1、2d時OD無明顯變化,3d后OD值出現(xiàn)了明顯增加直到第7d時達最大值。A組轉(zhuǎn)染后的細胞在第1d和2d時OD值未見明顯增長,第2天后OD值逐漸增長,增長幅度不及原代細胞大,OD值在第6d達高峰后緩慢下降進入平臺期。B組及C組細胞OD值與生長曲線與A組細胞相當,兩兩對比未見明顯統(tǒng)計學意義。而D組細胞與P3代普通兔BMSCs細胞OD值變化相比未見明顯統(tǒng)計學意義。(3)不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染4d后,酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)檢測見p IRES-h BMP2-h VEGF165轉(zhuǎn)染組BMP-2及VEGF-165基因表達達到最大化,分別與p IRES-h BMP2轉(zhuǎn)染組及p IRES-h VEGF165轉(zhuǎn)染組相比較,BMP-2和VEGF-165表達較單基因轉(zhuǎn)染組明顯升高,具有明確的統(tǒng)計學差異(P0.05),空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為陰性表達。(4)在不同組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染4d后,經(jīng)形態(tài)學觀察和免疫組化實驗明確p IRES-h BMP2-h VEGF165轉(zhuǎn)染組的Ⅰ型膠原、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素表達較p IRES-h BMP2轉(zhuǎn)染組及p IRES-h VEGF165轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組明顯提高,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:(1)利用脂質(zhì)體介導BMP-2、VEGF-165雙基因質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染對的兔骨髓基質(zhì)干細胞的增殖能力無明顯影響,與分別以BMP-2、VEGF-165單基因轉(zhuǎn)染相比無明顯區(qū)別;(2)雙基因轉(zhuǎn)染后VEGF-165和BMP-2基因在兔骨髓基質(zhì)干細胞中得到了良好表達,相較VEGF-165、BMP-2基因分別單獨轉(zhuǎn)染兔表達水平顯著提高,VEGF-165和BMP-2基因在共轉(zhuǎn)染兔BMSCs細胞后的表達相互促進,具有協(xié)同成骨作用;(3)BMP-2、VEGF-165雙基因轉(zhuǎn)染后的兔骨髓基質(zhì)干細胞相較單基因分別轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細胞具有更優(yōu)良的體外成骨能力,為接下來的實驗過程中構(gòu)建組織工程骨用于動物體內(nèi)長段骨缺損修復提供了研究基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R68

【參考文獻】

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本文編號：1735551