本文選題：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 + 細(xì)胞培養(yǎng)�。� 參考：《西南醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：第一部分大鼠ADSCs體外分離培養(yǎng)及CM-Di I標(biāo)記后的傳代示蹤目的:通過體外實(shí)驗(yàn)建立一種分離培養(yǎng)大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells;ADSCs)并將其用CM-Di I標(biāo)記的方法,探討CM-Di I標(biāo)記后的細(xì)胞用于傳代示蹤的可行性。方法:在無菌條件下剝離出大鼠腹股溝處的脂肪組織(去除血管和筋膜)并將其剪碎,Ⅰ型膠原酶消化脂肪組織,提取出原代細(xì)胞,并進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。對各代細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察,將第3代細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定,并將其進(jìn)行成脂成骨分化誘導(dǎo),以確定培養(yǎng)出的細(xì)胞為ADSCs。用CM-Di I標(biāo)記第3代ADSCs,熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察此代細(xì)胞的熒光標(biāo)記情況,并用流式細(xì)胞儀測定此代細(xì)胞的標(biāo)記率。將標(biāo)記后的ADSCs繼續(xù)培養(yǎng)并進(jìn)行消化傳代,在傳代至第6代和第9代時,用流式細(xì)胞儀分別測定這兩代ADSCs的標(biāo)記率。結(jié)果:在體外成功提取出ADSCs,其呈現(xiàn)長梭形、魚群樣、旋渦狀樣的生長。傳代后的細(xì)胞逐漸純化,并且生長增殖速度加快,細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。第3代ADSCs的表面重要標(biāo)志物CD29和CD90均陽性表達(dá)(表達(dá)率分別為95.04%、99.65%),而造血細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45和CD31均陰性表達(dá)(表達(dá)率分別為0.17%、0.20%、0.14%)。ADSCs能進(jìn)行成脂成骨的誘導(dǎo)分化。CM-Di I能成功標(biāo)記ADSCs,標(biāo)記后的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光,隨著代數(shù)的增加,熒光強(qiáng)度逐漸減弱,至第9代仍未消失。流式細(xì)胞儀測定傳代后的ADSCs的CM-Di I標(biāo)記率,第3代時標(biāo)記率為97.09%,第6代時標(biāo)記率為66.21%,而第9代時標(biāo)記率仍有37.86%。結(jié)論:大鼠ADSCs具有很強(qiáng)的生長增殖能力,其能陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面重要標(biāo)志物,且具有成脂成骨的分化潛能。CM-Di I標(biāo)記ADSCs方便易行,標(biāo)記率高,示蹤效果良好,顯示其可成為細(xì)胞標(biāo)記示蹤的良好熒光染料,能為后續(xù)進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。第二部分注射型SIS與ADSCs的體外共培養(yǎng)目的:制備可注射型的豬小腸黏膜下層(Small intestinal submucosa;SIS),并探討其作為注射型生物支架材料與大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)的體外共培養(yǎng)情況。方法:將培養(yǎng)出的ADSCs用流式細(xì)胞儀進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定和成脂成骨的分化誘導(dǎo),并將其進(jìn)行CM-Di I熒光標(biāo)記。制備可注射型的SIS并將其與ADSCs復(fù)合培養(yǎng),HE染色觀察注射型SIS的脫細(xì)胞情況,掃描電鏡和熒光顯微鏡觀察注射型SIS及其與細(xì)胞復(fù)合后的情況。制備100%、75%、50%和25%濃度的注射型SIS材料浸提液,將ADSCs分別在各濃度的材料浸提液下培養(yǎng),CCK-8試劑盒檢測ADSCs在第1、3、5、7天的增殖情況和材料的毒性。Live/dead染色試劑盒檢測ADSCs在100%濃度的材料浸提液中第1、3、5、7天的存活情況。結(jié)果:分離培養(yǎng)出的ADSCs能陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面重要標(biāo)志物且具有成脂成骨的分化能力。HE染色顯示注射型SIS上無殘留細(xì)胞。掃描電鏡觀察到注射型SIS有較多大小不一的三維孔隙,ADSCs能在材料上很好的黏附,呈橢圓形和條索狀生長。CCK-8檢測顯示與材料共培養(yǎng)的ADSCs增殖率提高且材料無細(xì)胞毒性。Live/dead染色試劑盒檢測顯示ADSCs在100%材料浸提液中存活良好,并且與在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)第1、3、5、7天的死細(xì)胞比例沒有差別。結(jié)論:注射型SIS有良好的三維結(jié)構(gòu),無細(xì)胞毒性,與ADSCs復(fù)合具有良好的生物相容性,其促進(jìn)ADSCs的生長與增殖,顯示其可作為脂肪組織工程一種注射型的天然生物支架材料,為呈遞細(xì)胞提供一種新的形式。第三部分注射型SIS復(fù)合ADSCs治療大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)研究目的:再生醫(yī)學(xué)為燒傷創(chuàng)面提供了多種治療方式,尋找良好的皮膚替代物治療燒傷創(chuàng)面成為一大趨勢。為此,本文擬探討注射型SIS與大鼠ADSCs二者混合物注射治療大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的可行性。方法:將64只大鼠隨機(jī)分為A組(空白對照組)、B組(ADSCs組)、C組(注射型SIS組)、D組(注射型SIS㧏ADSCs組),每組16只大鼠,均用100℃沸水作用于大鼠背部皮膚10秒以造模。燙傷后即對創(chuàng)面邊緣和中心區(qū)域進(jìn)行注射治療,A、B、C、D四組分別注射1ml PBS液,1ml含有2×107 ADSCs的PBS液,1ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的注射型SIS,1ml 2×107 ADSCs和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的注射型SIS的二者混合物,用凡士林紗布和無菌紗布依次覆蓋創(chuàng)面,透氣膠帶環(huán)繞包扎大鼠軀干。在二者混合物注射治療后的第3、7、14、21天采用大體觀察、創(chuàng)面微血管密度、組織病理學(xué)及組織學(xué)免疫熒光的方法來評價二者混合物注射治療對大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的修復(fù)情況。結(jié)果:二者混合物注射治療后的第3天,A、B、C、D四組大鼠創(chuàng)面閉合率分別為7.75±1.30%,13.90±1.01%,14.7±1.10%,19.14±1.56%;第7天,四組大鼠創(chuàng)面閉合率分別為21.45±1.19%,41.34±5.80%,40.62±4.93%,58.28±2.62%;第14天,四組大鼠創(chuàng)面閉合率分別為50.91±1.28%,67.15±0.86%,69.54±0.81%,85.31±1.05%;第21天,四組大鼠創(chuàng)面閉合率分別為62.68±3.14%,82.19±1.61%,88.77±0.73%,100±0%。D組創(chuàng)面閉合率較A、B、C三組均高(P0.01)。二者混合物注射治療后的第7天,A、B、C、D四組創(chuàng)面微血管密度分別為(11.5±4.6,24.6±6.3,20.1±9.7,39.2±7.3)個/cm2,D組微血管密度均大于A、B、C三組(P0.05)。HE染色顯示D組新生血管較另外三組多,而炎癥細(xì)胞浸潤最少。呈現(xiàn)綠色熒光的CD31部分能與呈現(xiàn)紅色熒光的ADSCs在同一創(chuàng)面區(qū)域共存,顯示出橢圓狀的新生血管結(jié)構(gòu)。二者混合物注射治療后的第21天,B、C、D三組創(chuàng)面均有新生表皮生成,且D組新生表皮最厚,而A組未見明顯新生表皮生成。呈現(xiàn)綠色熒光的CK10部分能與呈現(xiàn)紅色熒光的ADSCs在同一創(chuàng)面區(qū)域共存,顯示出表皮樣的結(jié)構(gòu)。結(jié)論:注射型SIS與ADSCs二者混合物注射治療能通過提高創(chuàng)面閉合率,促進(jìn)新生血管生成,減少炎癥細(xì)胞浸潤,促進(jìn)創(chuàng)面新生表皮再生的作用來促進(jìn)大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的修復(fù)。
[Abstract]:In vitro , ADSCs were isolated and cultured with CM - Di I . The results showed that ADSCs were successfully extracted from rat inguinal region by flow cytometry . In vitro co - culture of ADSCs with ADSCs was studied by using flow cytometry .

【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R644

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1735310