本文選題：胰腺特異性表達(dá)　切入點(diǎn)：胰腺缺陷　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：器官移植是治療人類器官衰竭,挽救人類生命的有效方法。但器官移植供體嚴(yán)重短缺,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足患者的需要。隨著科學(xué)研究的深入和科學(xué)技術(shù)的提高,異種器官移植逐漸成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。小型豬的血液生理生化指標(biāo)與人類接近,器官大小也接近于人,生長(zhǎng)周期又短,因此小型豬可以作為制備特殊器官的生物反應(yīng)器,成為異種器官移植供體來(lái)源的最佳提供者。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)研究的發(fā)展,利用人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行人豬嵌合,在豬體內(nèi)長(zhǎng)出人的器官成為器官移植供體可靠來(lái)源之一。糖尿病和胰腺癌都有造成胰腺器官衰竭的可能,隨時(shí)都有生命危險(xiǎn),隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)能力的提高和醫(yī)院移植技術(shù)的不斷完善,糖尿病和胰腺癌患者對(duì)胰腺移植的需求與日俱增,但胰腺移植也面臨同樣的問(wèn)題,供體嚴(yán)重缺乏,配型困難。利用人豬嵌合技術(shù),在胰腺缺陷的豬胚胎中注入患者的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞,讓豬體內(nèi)長(zhǎng)出病人的胰腺,不僅解決了糖尿病和胰腺癌患者胰腺移植供體不足的問(wèn)題,同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了個(gè)性化器官移植,減少免疫排斥。要實(shí)現(xiàn)這項(xiàng)生產(chǎn)胰腺的偉大工程,首先我們要制備出胰腺缺陷的豬胚胎。PDX1在胰腺生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演重要角色,特異地表達(dá)于胰腺中;Notch信號(hào)通路對(duì)早期胰腺發(fā)育及胰腺細(xì)胞命運(yùn)決定起到重要的調(diào)節(jié)作用,Hes1是Notch信號(hào)通路下游重要的調(diào)控轉(zhuǎn)錄效應(yīng)因子,其基因編碼的蛋白主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄抑制,通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制影響胚胎發(fā)育期的細(xì)胞增殖和分化。本研究以eGFP為報(bào)告基因,Hes1為目的基因,構(gòu)建了胰腺特異性表達(dá)載體PDX1-eGFP和PDXl-Hes1。通過(guò)體外轉(zhuǎn)染小鼠胰島β細(xì)胞試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證載體在體外的特異性表達(dá),通過(guò)制備轉(zhuǎn)基因小鼠的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證載體在體內(nèi)的特異性表達(dá)情況以及對(duì)胰腺缺陷動(dòng)物模型的制備進(jìn)行相關(guān)探索,本研究為制備胰腺缺陷豬胚胎奠定基礎(chǔ)。主要試驗(yàn)結(jié)果如下:試驗(yàn)一:胰腺特異性表達(dá)載體PDX1-eGFP和PDX1-Hes1的構(gòu)建及體外驗(yàn)證。成功構(gòu)建了 PDX1-eGFP和PDX1-Hes1這兩個(gè)載體。PDX1-eGFP轉(zhuǎn)染小鼠胰島β細(xì)胞和成纖維細(xì)胞48 h后,熒光顯微觀察結(jié)果為在小鼠胰島β細(xì)胞中發(fā)光,而在非胰腺細(xì)胞的成纖維細(xì)胞中不發(fā)光,說(shuō)明PDX1-eGFP的表達(dá)具有胰腺特異性轉(zhuǎn)染48h,提取細(xì)胞蛋白,開(kāi)始用Western Blot檢測(cè)。得到的結(jié)果是,小鼠胰島β細(xì)胞蛋白有eGFP表達(dá),成纖維細(xì)胞蛋白無(wú)eGFP表達(dá),同樣說(shuō)明PDX1-eGFP的表達(dá)具有胰腺特異性。PDX1-Hes1和空載體分別轉(zhuǎn)染小鼠胰島β細(xì)胞48h后,提取RNA和蛋白,經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)和Western Blot分析,結(jié)果均顯示,Hes1在轉(zhuǎn)PDX1-Hes1的小鼠胰島β細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于轉(zhuǎn)空載體的小鼠胰島β細(xì)胞,這說(shuō)明PDX1-Hes1可以使Hes1基因在胰腺細(xì)胞中特異性過(guò)表達(dá)。試驗(yàn)二:PDX1-eGFP和PDX1-Hes1在小鼠體內(nèi)的表達(dá)研究。通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠的制備,成功獲得了 1只PDX1-eGFP小鼠和2只PDX1-Hes1小鼠。PDX1-eGFP小鼠通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)和Western B1ot分析,結(jié)果均表明,eGFP在PDX1-eGFP小鼠的胰腺中表達(dá),而在PDX1-eGFP小鼠的肝中與對(duì)照小鼠的胰腺和肝臟中均不表達(dá);更有說(shuō)服力的一個(gè)結(jié)果是,通過(guò)活體熒光觀察,PDX1-eGFP小鼠僅胰腺部位有明顯綠色熒光,而PDX1-eGFP小鼠的其他部位和對(duì)照小鼠的全身均無(wú)綠色熒光。這說(shuō)明eGFP在PDX1啟動(dòng)子的啟動(dòng)下在小鼠體內(nèi)的胰腺中特異性表達(dá)。PDX1-Hes1小鼠通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),結(jié)果均顯示,Hes1在PDX1-Hes1小鼠胰腺中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組小鼠胰腺;PDX1-Hes1小鼠雖未造成胰腺缺陷,但從解剖形態(tài)觀察上看,胰腺還是存在一定程度異常的,這可能跟載體的保存方式、載體的完整度、載體真正的濃度、載體插入的隨機(jī)性、Hes1過(guò)表達(dá)的量等有關(guān)。
[Abstract]:In this study , the expression of PDX1 - eGFP and PDXl - Hes1 in the pancreas of the pancreas were studied . PDX1 - eGFP mice were expressed in the pancreas of PDX1 - eGFP mice . The results showed that the expression of PDX1 - eGFP and PDX1 - Hes1 in the pancreas of PDX1 - eGFP mice was significantly higher than that of control mice .

【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78;R657.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 蘇艷;王世民;邵俊高;張寶江;韋海娜;;Kozak序列對(duì)金黃色葡萄球菌黏附因子FnBPA-A DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答的影響[J];生物工程學(xué)報(bào);2013年04期

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本文編號(hào)：1720168