本文選題：胚胎干細胞　切入點：軟骨　出處：《吉林大學》2015年碩士論文

【摘要】：關(guān)節(jié)軟骨作為關(guān)節(jié)中至關(guān)重要的部分，具有緩解關(guān)節(jié)面摩擦，減輕骨骼運動壓力等重要作用。但由于其缺乏自我修復(fù)的能力，旦遭受外界創(chuàng)傷或衰退將造成關(guān)節(jié)軟骨損傷、骨關(guān)節(jié)炎等軟骨疾病，很難治愈。 干細胞移植技術(shù)為軟骨疾病的修復(fù)帶來希望。人胚胎干細胞(humanembryonic stem cells，hESCs)由于其無限的增殖能力及多向分化潛能等優(yōu)點，作為種子細胞明顯優(yōu)于成體干細胞或祖細胞；其個體差異小的優(yōu)勢使其能夠快速建立分化平臺，同時為iPSCs的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。通過體外誘導hESCs成軟骨分化可以獲得適宜的軟骨組織及足夠數(shù)量的軟骨細胞,為軟骨修復(fù)提出有別于傳統(tǒng)治療的新途徑。 在本課題中，我們采用兩個階段對hESCs進行軟骨分化：中胚層分化階段和從中胚層向軟骨分化階段。分化過程應(yīng)用無血清的條件培養(yǎng)基，采取多種生長因子及小分子的組合。hESCs來源的軟骨中胚層分化的條件培養(yǎng)基中主要包括CHIR (種高效、特異的GSK-3抑制劑，主要作用是激活WNT信號通路)，Noggin (BMP通路抑制劑)；后期從中胚層細胞向軟骨分化時應(yīng)用3D微球法培養(yǎng)，并結(jié)合了對軟骨分化有促進作用的因子PDGF、 TGFβ、BMP等。3D微球培養(yǎng)后，細胞顯示了顯著的軟骨相關(guān)性質(zhì)，形成了透明軟骨樣球狀團塊。在分化過程中，從形態(tài)變化、基因水平、蛋白水平、組織學染色等方面進行了體外檢測，并通過體內(nèi)移植實驗進步驗證形成的軟骨細胞，從而評價本課題方法對未來軟骨修復(fù)的可應(yīng)用性。 實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過中胚層分化，細胞主要表達MEOX1轉(zhuǎn)錄因子并顯示KDR-PDGFRα+表型,證明細胞經(jīng)過軸旁中胚層向透明軟骨方向分化；后期軟骨分化檢測結(jié)果表達SOX9等軟骨祖細胞基因及COL2、COMP等軟骨基質(zhì)基因，，免疫組化顯示COL2+COL1-,阿利新藍、甲苯胺藍等結(jié)果表明基質(zhì)含豐富的蛋白多糖，這些鑒定說明在體外無血清的誘導條件н hESCs向透明軟骨方向分化；通過細胞因子組合分化條件的探索發(fā)現(xiàn)，中胚層分化后若持續(xù)添加BMP4會導致阿爾新藍染色變淺，顯示基質(zhì)中蛋白多糖含量減少п利于軟骨分化；將分化的軟骨細胞或軟骨組織移植入免疫缺陷鼠體內(nèi)，仍然能夠維持軟骨表型，并發(fā)現(xiàn)細胞在體內(nèi)進步分化成熟。 綜т所述，課題初步證明了通過無血清條件培養(yǎng)基可以誘導hESCs成軟骨分化，并取得理想的分化結(jié)果和較高的分化效率。這п僅為胎肝干細胞在體外進行軟骨誘導提供新的實驗依據(jù)，也為未來應(yīng)用干細胞療法治愈骨關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)軟骨損傷等軟骨疾病奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Articular cartilage, as an important part of joint, plays an important role in relieving joint surface friction and bone movement pressure.However, due to its lack of self-repair ability, suffering from external trauma or decline will cause cartilage injury, osteoarthritis and other cartilage diseases, it is difficult to cure.Stem cell transplantation is promising for the repair of chondrocytes.Human embryonic stem cells (HSCs) are superior to adult stem cells or progenitor cells as seed cells because of their infinite proliferative ability and multidirectional differentiation potential.At the same time, it lays a foundation for the research of iPSCs.Proper cartilage tissue and a sufficient number of chondrocytes can be obtained by inducing hESCs chondrogenic differentiation in vitro, which provides a new approach to cartilage repair, which is different from the traditional treatment.In this study, we used two stages of cartilage differentiation in hESCs: mesodermal differentiation and mesodermal to cartilage differentiation.In the process of differentiation, serum-free conditioned medium was used, and the conditional medium for differentiation of cartilage mesoderm derived from the combination of various growth factors and small molecules, HESCs, mainly included CHIR (highly efficient and specific GSK-3 inhibitor).The main role was to activate the WNT signaling pathway, the inhibitor of the Noggin WNT pathway, to culture the mesoderm cells into cartilage by 3D microspheres at the late stage, and to combine with the factors of promoting cartilage differentiation, such as PDGF, TGF 尾, BMP and so on, after cultured with 3D microspheres.The cells showed significant chondrogenic properties and formed hyaline chondroid bulbous masses.In the process of differentiation, the changes of morphology, gene level, protein level and histological staining were detected in vitro, and the developed chondrocytes were verified by in vivo transplantation experiments.Therefore, the application of this method to cartilage repair in the future is evaluated.The results showed that after mesodermal differentiation, the cells mainly expressed MEOX1 transcription factors and showed the phenotype of KDR-PDGFR 偽, which proved that the cells differentiated into hyaline cartilage through the paraxial mesoderm.Chondroid progenitor cells such as SOX9 and cartilage matrix gene COL2COMP were expressed in later stage chondrogenic differentiation assay. The results of immunohistochemistry showed that COL2 COL1, alisin blue and toluidine blue contained abundant proteoglycans in the matrix.These results indicate that hESCs differentiates into hyaline cartilage under serum-free induction in vitro, and through the study of cytokine combination and differentiation conditions, it is found that adding BMP4 to mesoderm after differentiation can result in light staining of Arxin blue.The results showed that the reduction of proteoglycan content in the matrix was beneficial to cartilage differentiation, and the transplantation of differentiated chondrocytes or chondrocytes into immunodeficient mice could still maintain the cartilage phenotype, and found that the cells improved differentiation and maturation in vivo.In this paper, it is preliminarily proved that hESCs can be induced into cartilage differentiation by serum-free medium, and the ideal differentiation result and high differentiation efficiency can be obtained.It only provides a new experimental basis for cartilage induction of fetal liver stem cells in vitro and lays a foundation for the treatment of osteoarthritis and articular cartilage injury by stem cell therapy in the future.
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R681.3

【共引文獻】

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本文編號：1716783