本文選題：脊髓損傷　切入點(diǎn)：氧化應(yīng)激　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：近些年,人類脊髓損傷發(fā)病率呈遞增趨勢(shì),其嚴(yán)重致殘性不言而喻。脊髓損傷可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩大類。后者是指在脊髓受外力作用后,損傷區(qū)域產(chǎn)生復(fù)雜的生理生化反應(yīng),損害周圍正常脊髓組織,導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)域變大。目前大多數(shù)脊髓損傷的研究關(guān)注于繼發(fā)性脊髓損傷。脊髓損傷涉及的病理機(jī)制較多、治療效果不理想,當(dāng)前脊髓損傷的治療主要從抗炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡等機(jī)制著手。氧化應(yīng)激是繼發(fā)性脊髓損傷中神經(jīng)元壞死、凋亡,神經(jīng)功能紊亂的重要因素。日本學(xué)者Ohsawa于2007年研究發(fā)現(xiàn),氫氣可以選擇性清除羥基和過氧亞硝基陰離子,降低腦梗死面積,改善腦功能,這一發(fā)現(xiàn)引起人們對(duì)氫氣的廣泛研究。近些年,越來越多的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)氫分子在抗氧化應(yīng)激損傷方面發(fā)揮作用。氫氣作為一種新的抗氧化劑,具有滲透性好、來源廣泛等特點(diǎn),因此本研究通過培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞、制作神經(jīng)元機(jī)械損傷模型,發(fā)現(xiàn)高濃度氫氣在減輕氧化應(yīng)激損傷、保護(hù)線粒體功能、抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮作用,有望為脊髓損傷提供治療選擇。第一部分:脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定此部分實(shí)驗(yàn)我們以出生四天的雌性小鼠為原料,采用差速貼壁法純化和培養(yǎng)原代神經(jīng)元細(xì)胞,采用脊髓神經(jīng)元特異性染色(烯醇化酶染色)對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行鑒定,免疫熒光顯微鏡下可見神經(jīng)元成黃綠色,布滿整個(gè)視野,神經(jīng)元突起清晰。結(jié)果提示成功分離和培養(yǎng)小鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞。第二部分:不同濃度氫氣對(duì)機(jī)械損傷性神經(jīng)元的形態(tài)作用分析此部分實(shí)驗(yàn)我們研究三種不同濃度(50%、65%和75%)氫氣對(duì)機(jī)械損傷性神經(jīng)元形態(tài)的影響,采用神經(jīng)元機(jī)械損傷模型,光鏡結(jié)果見75%氫氣組在給予氫氣治療后損傷區(qū)域脊髓神經(jīng)元細(xì)胞有少量遷移,神經(jīng)特異性烯醇化酶NSE免疫熒光染色結(jié)果見各組差異不明顯,微絲微管的免疫熒光染色結(jié)果見75%氫氣治療組的細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)均勻,細(xì)胞骨架伸展,提示濃度為75%的氫氣較濃度為50%和65%的氫氣在神經(jīng)元機(jī)械損傷模型中更有利于神經(jīng)元的遷移,維持神經(jīng)元形態(tài)。第三部分:高濃度氫氣對(duì)機(jī)械損傷性神經(jīng)元的保護(hù)作用分析此部分實(shí)驗(yàn)我們研究濃度為75%的氫氣對(duì)機(jī)械損傷性神經(jīng)元的保護(hù)作用,采用超氧化物陰離子熒光探針檢測(cè)術(shù)后各組神經(jīng)元活性氧自由基含量;流式細(xì)胞儀和Tunel染色檢測(cè)神經(jīng)元的凋亡情況;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)MDA和8-OhdG的含量、Western blot檢測(cè)SOD1、SOD2、Nox2和Nox4的含量。結(jié)果顯示脊髓神經(jīng)元損傷后ROS、MDA、8-OhdG、Nox2和Nox4的含量增高,SOD1、SOD2含量降低;高濃度氫氣治療后ROS、MDA、8-Ohd G、Nox2和Nox4的含量降低,SOD1、SOD2含量升高;流式細(xì)胞儀和Tunel染色結(jié)果顯示脊髓神經(jīng)元損傷后神經(jīng)元凋亡增多,高濃度氫氣治療后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)降低,以上結(jié)果提示濃度為75%的氫氣抑制Nox2和Nox4的表達(dá),提高抗氧化酶SOD1、SOD2的表達(dá),抑制ROS生成、減輕脂質(zhì)過氧化、抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。第四部分:高濃度氫對(duì)脊髓神經(jīng)元線粒體的作用研究此部分實(shí)驗(yàn)我們研究濃度為75%的氫氣對(duì)脊髓神經(jīng)元線粒體的影響,觀察術(shù)后各組神經(jīng)元線粒體的超微結(jié)構(gòu)、檢測(cè)線粒體膜電位變化、神經(jīng)元ATP含量、抗氧化酶、凋亡蛋白含量,結(jié)果顯示神經(jīng)元機(jī)械損傷后線粒體受損、膜電位降低、ATP含量降低,Bax和caspase 3表達(dá)上調(diào)、Bcl-2表達(dá)下調(diào)、抗氧化酶Prx III和Trx2含量降低,給予氫氣治療后受損線粒體有所恢復(fù)、膜電位和ATP含量提高、Bax和caspase3表達(dá)下調(diào)、Bcl-2表達(dá)上調(diào)、抗氧化酶PrxIII和Trx2含量提高,以上結(jié)果提示濃度為75%的氫氣抗氧化損傷、抑制線粒體凋亡途徑激活,保護(hù)線粒體功能、抑制神經(jīng)元凋亡。綜上所述,高濃度氫氣可上調(diào)神經(jīng)元SOD1、SOD2、PrxIII和Trx2的表達(dá),抑制Nox2和Nox4蛋白的表達(dá),從而減少活性氧自由基ROS的生成,抑制Caspase3和Box的表達(dá),抑制線粒體凋亡途徑的激活,抑制神經(jīng)元的凋亡。本項(xiàng)研究有望成為治療脊髓損傷的另一可行選擇。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R651.2

【參考文獻(xiàn)】

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