本文選題：白介素22融合蛋白　切入點：部分肝切除　出處：《安徽醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：背景原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是當今世界最常見的惡性腫瘤之一,手術仍被認為是目前最為有效的治療手段。肝臟再生不足和缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury,IRI)是部分肝臟切除手術(Partial hepatectomy,PHx)術后面臨的兩大難題,多數(shù)患者由于伴有基礎肝臟疾病或病變范圍過大,如若手術,則術后極有可能因為肝臟再生不足而誘發(fā)急性肝衰竭,造成病人死亡。盡管白細胞介素22(Interleukin 22,IL-22)對于肝臟的保護作用及對正常小鼠單純PHx術后肝臟再生的促進作用已被發(fā)現(xiàn),目前仍缺少IL-22對伴有基礎肝病的小鼠PHx術后肝臟再生作用的研究數(shù)據(jù)。另外,之前的研究者所使用的IL-22多為常規(guī)重組人白介素22蛋白(Recombinant human interleukin 22,rh-IL-22),而對于作用時間更長、分子量更大的白介素22融合蛋白(Interleukin 22 fusion protein,IL-22-FP)對肝臟保護及肝再生作用的研究甚少。為了更加真實的模擬臨床病人的實際情況,進一步研究IL-22-FP對肝臟再生的作用,設計了本論文實驗,探討IL-22-FP對伴有基礎肝病的小鼠PHx術后肝臟的保護作用及肝再生的促進作用,同時探究IL-22-FP對小鼠肝臟缺血再灌注(IR)損傷的保護作用,為擴大PHx手術適應癥,減少手術患者術后死亡率提供數(shù)據(jù)支持。目的研究IL-22-FP對伴有基礎肝病小鼠PHx術后肝臟的保護及肝再生的作用及其機制。方法1.應用刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)、四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)等化學物質(zhì)制造小鼠基礎肝損傷模型,在此基礎上行2/3PHx手術,術前30min靜脈給予IL-22-FP(125μg/kg)或者等量對照(PBS)治療。Con A模型小鼠隨機分為以下幾組:1.單一Con A損傷組:Con A組;2.單一PHx手術組:PHx組;3.Con A損傷加PHx手術組:Con A+PHx組;4.Con A損傷加PHx手術加IL-22-FP治療組:Con A+PHx+IL-22-FP組。CCl4模型小鼠同樣的方法分為以下4組:1.CCl4組(單一CCl4損傷組);2.PHx組(單一PHx手術組);3.CCl4+PHx組(CCl4損傷加PHx手術組);4.CCl4+PHx+IL-22-FP組(CCl4損傷加PHx手術加IL-22-FP治療組)。術后不同時間點(32h,40h,48h,1w)過量麻醉法處死小鼠,獲取小鼠血清和肝臟組織用于后續(xù)研究。2.通過阻斷小鼠部分肝葉血流(70%),90 min后恢復血流,制造小鼠肝臟IRI模型,術前30min靜脈給予IL-22-FP(125μg/kg)或者等量對照(PBS)治療,再灌注后不同時間點(6h,24h,48h)處死小鼠,獲取血清和肝臟組織樣本。IRI模型小鼠隨機分為4組,分別為:1.假手術組:Sham組;2.單一IRI手術組:IRI組;3.IRI手術加普通白介素22(rh-IL-22)治療組:IRI+rh-IL-22組;4.IRI手術加白介素22融合蛋白治療組:IRI+IL-22-FP組。3.應用全自動生化分析儀測定小鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平,作為衡量肝臟損傷程度的指標之一。4.取出固定于10%甲醛溶液中的部分小鼠肝臟組織,用于5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2,-deoxyuridine,Brd U)染色。染色陽性細胞即為增殖的肝細胞,通過計算Brd U陽性率(Brd U+肝細胞數(shù)/肝細胞總數(shù))來比較不同組別小鼠肝臟再生的水平。5.部分肝組織樣本用于蘇木精-伊紅(Hematoxylin and eosin,HE)染色。通過染色,觀察肝臟組織壞死范圍、程度及炎性細胞浸潤情況,用以反應肝臟損傷的程度。6.應用蛋白免疫印記技術(Western blot,WB)定量檢測不同組別小鼠肝臟組織中與肝臟再生相關蛋白如增殖細胞核抗原(PCNA)、細胞周期蛋白(Cyclin B1,Cyclin D1)及信號轉(zhuǎn)導子及轉(zhuǎn)錄激活子3(Signal transducer and activator of transcription,STAT3)和p-STAT3蛋白的表達情況。結(jié)果1.在Con A模型中,低劑量(42μg/kg,Low dose group)IL-22-FP治療組小鼠比中(125μg/kg,Middle dose group)、高(375μg/kg,High dose group)劑量IL-22-FP治療組小鼠肝組織損傷更嚴重,血清ALT水平更高,Brd U陽性率更低。而中、高劑量組之間的這些差異并不明顯。2.IL-22-FP能夠有效減輕Con A誘導的小鼠肝組織損傷,促進Con A模型小鼠PHx后的肝再生,其機制可能與激活的p-STAT3及誘導的PCNA、Cyclin D1蛋白的表達有關同常規(guī)重組IL-22治療組及其他手術組相比,IL-22-FP治療組在PHx術后血清ALT及AST水平均顯著降低,炎癥細胞浸潤及肝組織壞死程度明顯減輕。術后不同時間點IL-22-FP治療組肝指數(shù)(肝臟重量/體重,LW/BW)及Brd U陽性率均明顯高于其他未治療組和常規(guī)重組IL-22治療組。WB結(jié)果發(fā)現(xiàn),術后32h同其他組相比,IL-22-FP治療組小鼠肝組織p-STAT3、PCNA及Cyclin D1蛋白的表達量也明顯升高。3.IL-22-FP能夠顯著減輕CCl4導致的肝損傷,促進CCl4模型小鼠PHx術后的肝再生,并誘導肝組織中p-STAT3、Cyclin B1、Cyclin D1及PCNA蛋白的表達肝指數(shù)結(jié)果可見,術后32、40及48h,IL-22治療組小鼠肝指數(shù)水平明顯高于其他組;與肝指數(shù)類似的是,術后32、40及48h IL-22-FP治療組Brd U陽性率也顯著高于其他組,而術后1w時,各組均很難見到染色陽性細胞。WB結(jié)果顯示,IL-22-FP治療組術后肝臟組織p-STAT3、PCNA、Cyclin D1及Cyclin B1等蛋白表達量明顯多于其他未治療組,差異顯著。4.IL-22FP能夠有效保護肝臟,顯著減輕肝臟缺血再灌注損傷在IRI小鼠模型中,IL-22-FP治療組同rh-IL-22治療組及其他手術組相比在再灌注后24及48h血清AST水平顯著降低;HE染色切片可以看到在再灌注后48h IL-22-FP治療組小鼠肝組織缺血壞死范圍也較其他組更小。結(jié)論1.IL-22-FP能夠有效保護肝臟,減輕Con A、CCl4和PHx引起的小鼠肝臟損傷。2.IL-22-FP能夠顯著提高Con A和CCl4模型小鼠PHx術后的肝臟再生水平。3.IL-22-FP可減輕小鼠肝臟缺血再灌注損傷,且效果優(yōu)于rh-IL-22。4.IL-22-FP對肝臟的保護及肝再生的促進作用可能與STAT3通路的激活及其誘導的相關基因(如Cyclin D1、Cyclin B1等)的表達有關。
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【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R657.3

【參考文獻】

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本文編號：1660269