本文選題：椎間盤退變　切入點：椎間盤內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持系統(tǒng)　出處：《第三軍醫(yī)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景及目的腰痛(low back pain, LBP)已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛流行,是導(dǎo)致勞動力喪失的主要疾病之一。椎間盤(Intervertebral disc,IVD)退變(Intervertebral disc degeneration, IDD)是LBP的一個重要的特異性致病因素。因此,預(yù)防、延緩或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變被認為是一種非常具有臨床應(yīng)用前景的治療LBP的策略。然而,迄今為止,我們對椎間盤退變發(fā)病機制的了解還非常有限。最新的研究認為:椎間盤退變是一個由多種危險因素引起的,椎間盤細胞所介導(dǎo)的自身結(jié)構(gòu)和功能逐漸破壞的過程,其發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是椎間盤內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持系統(tǒng)的破壞。該系統(tǒng)主要由椎間盤內(nèi)的體細胞和內(nèi)源性干細胞組成。其中,具有自我更新和多向分化潛能的內(nèi)源性干細胞被認為可以感受椎間盤內(nèi)存活和功能細胞數(shù)量的減少以及椎間盤的結(jié)構(gòu)損傷,然后遷移至損傷部位并分化為組織特異性細胞,從而維持椎間盤內(nèi)存活和功能細胞數(shù)量的穩(wěn)定,最終參與維持椎間盤結(jié)構(gòu)與功能的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。因此,椎間盤內(nèi)的內(nèi)源性干細胞的遷移與多向分化能力對于椎間盤結(jié)構(gòu)和功能的內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。在我們的前期研究中,我們在人軟骨終板中發(fā)現(xiàn)了可以成軟骨、成骨和向髓核樣細胞分力的干細胞,并命名為軟骨終板干細胞(cartilage endplate stem cells,CESCs)。因此,我們推測CESCs在椎間盤內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。但是,我們對于CESCs遷移和分化機制的了解還非常有限。有證據(jù)表明,趨化因子及其受體是促使干細胞遷移的一個重要因素。然而,至今還沒有研究去探討椎間盤內(nèi)促進CESCs遷移的趨化因子及其具體機制。另一方面,CESCs的分化方向是受到多種椎間盤微環(huán)境因素影響的,退變椎間盤內(nèi)復(fù)雜的生物化學和物理微環(huán)境又是復(fù)雜而惡劣的。在退變微環(huán)境的影響下,遷移到損傷部位的CESCs是分化為具有“修復(fù)”功能的體細胞而發(fā)揮內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持作用;還是發(fā)生“負面轉(zhuǎn)化”而進一步破壞椎間盤的內(nèi)穩(wěn)態(tài),這是一個值得深入探討的問題。N-acetylted proline-glycine-proline (N-Ac-PGP)是一種由膠原蛋白降解產(chǎn)生的趨化因子,能夠作用于中性粒細胞表面的CXCR1/2受體來趨化中性粒細胞,從而廣泛參與到諸如急性肺部感染、慢性阻塞性肺病、炎性腸病、缺血性腦梗死等炎癥性疾病中。然而,至今還沒有研究去證明N-Ac-PGP是否存在于退變的椎間盤中,特別是在以膠原蛋白降解為主要病理學特征的退變髓核組織中。本研究的目的在于通過液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、ELISA和免疫熒光等實驗方法明確人退變髓核組織中N-Ac-PGP的存在情況及其產(chǎn)生的分子途徑,并通過體內(nèi)外實驗重點探討N-Ac-PGP對CESCs遷移和分化的調(diào)控作用。本研究的實驗結(jié)果可以為進一步闡明椎間盤退變的發(fā)病機制提供新的實驗證據(jù),同時,也為進一步完善基于干細胞的椎間盤再生修復(fù)的方法提供了新的理論依據(jù)。方法通過手術(shù)獲取人體髓核組織標本,利用免疫組織化學染色,酶聯(lián)免疫吸附實驗和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析檢測髓核組織中N-Ac-PGP生成相關(guān)蛋白酶和N-Ac-PGP本身的存在情況和濃度,并通過相關(guān)性分析明確椎間盤退變程度與髓核組織中N-Ac-PGP濃度的關(guān)系。對人髓核細胞進行原代培養(yǎng),利用免疫熒光染色確定髓核細胞是否表達與N-Ac-PGP生成相關(guān)蛋白酶,并利用N-Ac-PGP的間接體內(nèi)生成實驗明確髓核細胞是否可以降解膠原蛋白生成N-Ac-PGP。接下來,對人CESCs進行原代培養(yǎng),利用transwell遷移模型,熒光定量PCR,Western blot檢測,免疫熒光染色,F-actin染色以及CXCR1/2的抑制實驗去分析N-Ac-PGP對CESCs體外遷移的影響及其分子機制�；诩彝脛游锬Ｐ�,將N-Ac-PGP以及CXCR1/2拮抗劑注射進入家兔腰椎間盤,然后利用HE染色方法觀察N-Ac-PGP對軟骨終板內(nèi)細胞遷移的影響極其受體機制。另一方面,通過對家兔腰椎間盤切片進行免疫組織化學染色,明確受N-Ac-PGP誘導(dǎo)后向髓核遷移的細胞中的不同細胞類型。利用酶聯(lián)免疫吸附實驗,Western blot檢測,實時定量PCR檢測CESCs在N-Ac-PGP的作用下向髓核樣細胞表型和促炎癥表型的分化情況,明確N-Ac-PGP對CESCs分化的調(diào)控作用。結(jié)果1.人體髓核組織有N-Ac-PGP生成相關(guān)蛋白酶(MMP8, MMP9和PE)的存在。MMP8和MMP9的濃度隨著椎間盤退變程度的加重而升高。2.人體髓核組織中N-Ac-PGP的濃度與椎間盤的退變程度呈正相關(guān)。3.人髓核細胞在體內(nèi)和體外都表達MMP8, MMP9和PE。髓核細胞的條件培養(yǎng)基可以降解Ⅱ型膠原蛋白產(chǎn)生N-Ac-PGP,而且這種N-Ac-PGP的生成能力隨著椎間盤退變程度的增加而增加。4. N-Ac-PGP可以顯著促進CESCs的體外遷移。5. CESCs在細胞質(zhì)和細胞膜上表達CXCR1和CXCR2。在N-Ac-PGP的作用下,CXCR1和CXCR2在CESCs中的表達顯著上調(diào)。6. CXCR1和CXCR2的拮抗劑可以抑制N-Ac-PGP對CESCs體外遷移的促進作用。7. N-Ac-PGP促進CESCs中F-actin細胞骨架網(wǎng)絡(luò)的合成與重排,并誘導(dǎo)CESCs偽足的形成,而這種作用可以被CXCR1和CXCR2的拮抗劑所抑制。8.向家兔腰椎間盤內(nèi)注射N-Ac-PGP可以誘導(dǎo)軟骨終板內(nèi)細胞向髓核內(nèi)遷移,這種遷移可以被CXCR1和CXCR2拮抗劑所抑制。遷移的細胞中有表達MT-MMP1和CD105的軟骨細胞和表達MT-MMP1,CD105和Stro-1的梭型細胞。9. N-Ac-PGP抑制CESCs向髓核樣表型分化,并誘導(dǎo)CESCs向促炎癥表型分化。N-Ac-PGP的這種調(diào)控分化的作用也可以被CXCR1和CXCR2的拮抗劑所抑制。結(jié)論在椎間盤的微環(huán)境中,存在有由髓核細胞分泌MMP8, MMP9和PE級聯(lián)分解膠原蛋白而產(chǎn)生的N-Ac-PGP。N-Ac-PGP的濃度與椎間盤退變程度密切相關(guān)。N-Ac-PGP是椎間盤微環(huán)境中的趨化因子,它能夠結(jié)合CESCs的CXCR1和CXCR2來誘導(dǎo)其向髓核內(nèi)遷移,從而促使CESCs向組織損傷部位遷移。然而,在N-Ac-PGP的作用下,CESCs向髓核樣細胞的分化被抑制,導(dǎo)致CESCs在損傷部位不能正常發(fā)揮其對椎間盤結(jié)構(gòu)和功能內(nèi)穩(wěn)態(tài)的促進作用。更嚴重的是,N-Ac-PGP還會促進CESCs向促炎癥表型分化,這些促炎癥細胞會進一步加重椎間盤微環(huán)境中的基質(zhì)分解和炎癥反應(yīng),從而加速椎間盤結(jié)構(gòu)和功能內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞,最終加速椎間盤退變的進程。抑制N-Ac-PGP的大量生成可能是提高退變椎間盤干細胞治療的效率并促進椎間盤再生的新靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R681.5

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