本文選題：電場　切入點(diǎn)：自噬　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景皮膚是機(jī)體和外界環(huán)境接觸的最外層器官,作為機(jī)體的屏障,皮膚可抵御外來刺激和傷害、保護(hù)機(jī)體內(nèi)部組織。對于燒傷患者而言,燒傷創(chuàng)面既是燒傷對機(jī)體所造成損害的集中典型表現(xiàn)和燒傷診斷的重要依據(jù),也是燒傷治療的重點(diǎn)內(nèi)容和評價治療效果的關(guān)鍵指標(biāo)。在治療過程中,封閉創(chuàng)面(再上皮化)乃是燒創(chuàng)傷患者治療的焦點(diǎn),在該過程中,角質(zhì)形成細(xì)胞經(jīng)過一系列復(fù)雜精細(xì)的事件失去上皮細(xì)胞特征,獲得間充質(zhì)細(xì)胞特征(即上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換),從靜止細(xì)胞轉(zhuǎn)換運(yùn)動細(xì)胞,啟動遷移,并移行至創(chuàng)面。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換是創(chuàng)面愈合的基礎(chǔ),細(xì)胞獲得的遷移能力則是再上皮化過程的啟動事件及重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞完成啟動過程、獲得遷移能力后,沿著創(chuàng)面逐漸移行。在遷移過程中,角質(zhì)形成細(xì)胞經(jīng)過偽足形成、胞體收縮、粘附解離等過程縱向延伸,從創(chuàng)緣向創(chuàng)面遷移。自噬(本文中自噬皆指大自噬,macroautophagy)是通過溶酶體降解、再利用自身受損的細(xì)胞器和多余的大分子物質(zhì)的一條主要分解代謝途徑,降解的底物可以提供能量,重建細(xì)胞結(jié)構(gòu)。研究表明,自噬參與了生物體的發(fā)育、分化、免疫等過程,和某些疾病如腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。黏著斑、整合素家族、黏著斑激酶和Rho家族相關(guān)蛋白等在細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮著重要作用,自噬可降解多種細(xì)胞中的黏著斑腳手架蛋白、信號整合器等,參與調(diào)控細(xì)胞遷移。正常皮膚中存在著跨上皮電勢差,創(chuàng)面形成后,跨上皮電勢差消失,同時產(chǎn)生內(nèi)源性的直流電場。該直流電場以創(chuàng)緣為正極,創(chuàng)面中心為負(fù)極,在創(chuàng)面修復(fù)的全過程中持續(xù)存在并影響細(xì)胞的行為。研究表明,電場是指導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞從創(chuàng)緣向創(chuàng)面定向移行的關(guān)鍵微環(huán)境因素,但其促進(jìn)細(xì)胞啟動及獲得運(yùn)動能力的機(jī)制尚不清楚�？紤]到上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換及自噬在細(xì)胞遷移中的重要作用,我們推測或許與這兩種現(xiàn)象有關(guān),但電場是否及如何引起細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換、加電時細(xì)胞內(nèi)自噬活性如何、自噬是否與角質(zhì)形成細(xì)胞遷移有關(guān)等問題均不得而知,故本課題著眼于這些問題,探索創(chuàng)面修復(fù)過程中電場與細(xì)胞遷移的關(guān)系以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換和自噬在遷移中發(fā)揮的作用。急性創(chuàng)面形成時,患者皮膚屏障受損,體液丟失,機(jī)體有效循環(huán)血量減少,組織氧供及血供減少;創(chuàng)面局部血管網(wǎng)受損后,組織的氧供進(jìn)一步減少,同時由于創(chuàng)面肉芽組織生成、炎癥細(xì)胞浸潤等,組織氧耗增加。整體因素和局部因素共同作用,氧供和氧耗失去平衡,創(chuàng)緣組織處于缺氧狀態(tài)。在創(chuàng)面修復(fù)過程中,缺氧微環(huán)境持續(xù)存在并影響修復(fù)過程,直至再上皮化完成后才會消失,因此其重要性不言而喻。研究表明,缺氧環(huán)境與角質(zhì)形成細(xì)胞開始遷移的時間及位置一致,在前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)缺氧可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生EMT,但它促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動性的相關(guān)機(jī)制尚不明確。故本課題通過多種實(shí)驗(yàn)技術(shù),研究創(chuàng)面修復(fù)過程中缺氧與細(xì)胞遷移的關(guān)系以及可能的機(jī)制。方法1.原代角質(zhì)形成細(xì)胞的分離與培養(yǎng)向皮膚組織中加入中性蛋白酶,置于4℃冰箱中16-18h。所得的表皮剪碎后用0.25%的胰酶消化6-7min。過濾所得混合物后,將濾液離心10min,棄上清,重新致懸計數(shù),根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求接種細(xì)胞。2.si RNA轉(zhuǎn)染稀釋lipofectamine 2000和si RNA溶液,將所得的兩種稀釋液輕柔混勻,室溫放置20min后加入細(xì)胞培養(yǎng)體系中。6h后更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24-48h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3.腺病毒轉(zhuǎn)染接種細(xì)胞在六孔板中,密度適宜時吸取腺病毒原液2μL,與2m L培養(yǎng)液混合,輕輕吹打混勻后加入培養(yǎng)板,在孵箱中培養(yǎng)24h后更換新鮮培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24-48h。其他類型的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)孔板或大、小爬片所需的試劑體積按培養(yǎng)面積、培養(yǎng)體積換算。4.材料制作用玻璃刀制作小爬片、大爬片、電場室、銀絲電極、鹽橋,改造Costar 24孔板,放入電場小室,通過鹽橋、ST導(dǎo)電液、電極等形成回路。5.加電處理細(xì)胞對電場室進(jìn)行消毒滅菌后,加入適量培養(yǎng)基,排除氣泡。將爬片放入電流通過的空間,固定。加入ST導(dǎo)電液,放入鹽橋、銀絲,置于培養(yǎng)箱中,接通外加電源,構(gòu)建回路。6.活細(xì)胞工作站檢測單個細(xì)胞運(yùn)動能力打開活細(xì)胞工作站,將電場小室與24孔板組合放入電場中。選擇視野,打開外接電源,調(diào)整電源輸出直至測量值達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求,拍照記錄。7.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞側(cè)向遷移能力細(xì)胞培養(yǎng)成為單層后,用槍頭自上而下均勻用力制作劃痕。沖洗,加入新鮮的培養(yǎng)液,拍照記錄,根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行處理(加入藥物或電場刺激)。之后每6h利用顯微鏡拍照,觀察細(xì)胞遷移情況。8.Western blot加入蛋白裂解液裂解所有細(xì)胞,刮下裂解液,吸出后存放于EP管中,在沸水中煮5-10min,徹底變性,定量,根據(jù)定量結(jié)果上樣。恒壓電泳后轉(zhuǎn)膜,裁剪目的條帶,用5%BSA或5%脫脂奶粉室溫封閉1-3h。按比例稀釋一抗,4℃冰箱中孵育18-20 h。次日用TBST洗膜,按比例稀釋二抗,室溫孵育1h后洗膜。曝光,保存圖像。9.免疫熒光染色用復(fù)溫的4%多聚甲醛固定爬片,打孔,3%BSA封閉1 h。按比例稀釋一抗,4℃冰箱中孵育18-20h。用PBS洗5次×3min后,按比例稀釋二抗,37℃孵育1h,隨后室溫孵育DAPI 5min染核,封片。激光共聚焦顯微鏡拍照,保存圖像。結(jié)果1.電場通過下調(diào)PTEN激活m TORC1而引起EMT,啟動細(xì)胞遷移。1.1外加直流電場處理可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生EMTWestern Blot及免疫熒光染色顯示,外加直流電場處理可顯著增加Snail、Slug、N-cadherin、波形蛋白的表達(dá)水平,且這種促進(jìn)作用呈時間依賴性,說明電場促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)換。1.2外加直流電場處理引起細(xì)胞運(yùn)動能力增加電場處理可明顯促進(jìn)單個細(xì)胞運(yùn)動距離及軌跡速度;電場組細(xì)胞遷移面積大約是正常組2倍,說明電場可顯著增加促進(jìn)單層細(xì)胞側(cè)向遷移。1.3外加直流電場處理抑制角質(zhì)形成細(xì)胞PTEN表達(dá)正常細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)水平較高,電場可引起其表達(dá)下降,加電時間越長,PTEN含量下降越明顯。1.4外加直流電場通過下調(diào)PTEN引起EMT用si RNA下調(diào)PTEN表達(dá)水平后,在相同的電場處理條件下,該組中Snail、Slug、N-cadherin、波形蛋白表達(dá)水平較單純加電細(xì)胞更高,E-cadherin表達(dá)水平更低,說明降低電場處理時的PTEN水平可進(jìn)一步促進(jìn)EMT發(fā)生。用腺病毒過表達(dá)PTEN后,在相同的電場處理條件下,該組Snail、Slug、N-cadherin、波形蛋白表達(dá)水平顯著降低,E-cadherin表達(dá)水平恢復(fù),提示過表達(dá)PTEN可抑制EMT發(fā)生。1.5外加直流電場通過下調(diào)PTEN促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動性在相同的電場處理條件下,進(jìn)一步下調(diào)PTEN后細(xì)胞運(yùn)動范圍增加,平均運(yùn)動距離及軌跡速度增大,過表達(dá)PTEN組細(xì)胞運(yùn)動范圍縮小,平均運(yùn)動距離及軌跡速度降低;劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。1.6外加直流電場可激活角質(zhì)形成細(xì)胞m TORC1通路p-p70S6K和p-4E-BP1的表達(dá)水平隨著電場處理時間的延長而逐漸增加,呈時間依賴性,說明電場處理可以激活m TORC1通路。1.7外加直流電場通過激活m TORC1通路引起EMT加電可促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)換,用Rapamycin處理抑制m TORC1后則會導(dǎo)致Snail、Slug、N-cadherin、波形蛋白表達(dá)水平顯著降低,E-cadherin表達(dá)水平恢復(fù),逆轉(zhuǎn)電場引起的EMT。1.8外加直流電場通過激活m TORC1通路促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動性電場處理使細(xì)胞的運(yùn)動范圍增加,運(yùn)動能力增強(qiáng),加入Rapamycin抑制m TORC1后細(xì)胞運(yùn)動范圍縮小,運(yùn)動速度下降,說明電場引起的m TORC1活化在單個細(xì)胞運(yùn)動性中發(fā)揮重要作用。劃痕實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果一致。1.9外加直流電場通過下調(diào)PTEN激活m TORC1通路電場處理可激活m TORC1,加入si PTEN會進(jìn)一步引起m TORC1活化;Rapamycin可顯著抑制m TORC1活性,但不影響PTEN的表達(dá)水平,說明PTEN可負(fù)向調(diào)控m TORC1的活性。在相同的電場處理條件下,加入Rapamycin會抑制si PTEN對EMT的誘導(dǎo),Snail、Slug、N-cadherin、波形蛋白表達(dá)水平下降,E-cadherin表達(dá)水平恢復(fù),說明PTEN下調(diào)誘導(dǎo)EMT時需要活化的m TORC1。1.10 m TORC1失活可抑制由PTEN下調(diào)所引起細(xì)胞運(yùn)動性與6h+si PTEN組相比,6h+si PTEN+Rapamycin組細(xì)胞運(yùn)動范圍明顯縮小,平均運(yùn)動距離、軌跡速度下降,有顯著統(tǒng)計學(xué)差異,說明PTEN下降引起的細(xì)胞運(yùn)動性增加需要m TORC1的參與。劃痕實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果一致。2.電場通過激活自噬促進(jìn)細(xì)胞定向遷移能力2.1外加直流電場處理促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞定向遷移正常情況下,細(xì)胞隨機(jī)向各個方向運(yùn)動,無明顯的方向性,運(yùn)動范圍較小。電場處理使細(xì)胞從正極向負(fù)極移動,運(yùn)動方向逐漸接近水平,細(xì)胞運(yùn)動范圍明顯增大,說明外加直流電場處理可以促進(jìn)細(xì)胞定向遷移。2.2外加直流電場處理可增加細(xì)胞自噬水平Western blot結(jié)果表明,電場可引起Ha Ca T和MKs細(xì)胞中自噬經(jīng)典標(biāo)志物L(fēng)C3-II、p62表達(dá)增多,這種促進(jìn)作用呈時間依賴性。電鏡結(jié)果顯示,正常情況下細(xì)胞中自噬水平很低,電場刺激后自噬數(shù)目增加,多為單層膜結(jié)構(gòu),是已經(jīng)成熟的自噬溶酶體,胞漿成分已部分或全部降解。用GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后加電處理,發(fā)現(xiàn)正常情況下細(xì)胞中自噬水平很低,綠色熒光無點(diǎn)狀聚集,加電后胞漿中出現(xiàn)大量點(diǎn)狀綠色熒光,即自噬體。該結(jié)果與前述結(jié)果一致,說明電場可增加細(xì)胞自噬水平。用針對LC3的抗體通過免疫熒光染色檢測細(xì)胞本身的內(nèi)源性蛋白,發(fā)現(xiàn)電場處理可以增加自噬水平。2.3電場條件下細(xì)胞自噬流通暢電場條件下,用ACTD處理細(xì)胞后,p62、LC3-II表達(dá)水平降至與正常細(xì)胞中p62、LC3-II表達(dá)量相等,說明加電時p62、LC3-II表達(dá)增高是由電場刺激基因轉(zhuǎn)錄、翻譯增加引起的。電場條件下,與單純加電組相比,CQ和Baf A1可引起p62、LC3-II水平顯著升高,說明加電時細(xì)胞自噬流通暢,抑制劑阻斷了降解過程的關(guān)鍵步驟,引起降解障礙,造成p62和LC3-II堆積。用GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞并加電,發(fā)現(xiàn)紅色熒光和綠色熒光完全重疊,形成嫩黃色,說明自噬體和溶酶體共定位好,提示二者融合無障礙,自噬流通暢。電鏡發(fā)現(xiàn)加電后細(xì)胞中自噬多為單層膜結(jié)構(gòu),是已經(jīng)成熟的自噬溶酶體,胞漿成分已部分或全部降解。說明加電時自噬體和溶酶體融合成熟無障礙,融合后可順利降解底物,提示自噬流通暢。2.4敲除ATG5基因引起細(xì)胞自噬水平下降在正常情況下,用si RNA敲減ATG5后,加電處理不再引起si ATG5細(xì)胞自噬水平增加,LC3下調(diào),p62累積,說明敲除ATG5可抑制電刺激對自噬的促進(jìn)作用。2.5電場條件下自噬促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞定向遷移正常情況下,細(xì)胞向各個方向運(yùn)動,無方向性,運(yùn)動軌跡集中,運(yùn)動范圍都比較小,電場處理可促進(jìn)細(xì)胞定向遷移。與加電組相比,敲除ATG5的細(xì)胞加電后仍可定向遷移,但運(yùn)動范圍減小,軌跡速度、位移速度、X軸方向位移速度顯著下降,說明外加直流電場處理通過自噬促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞定向遷移能力。3.1缺氧處理激活角質(zhì)形成細(xì)胞中m TORC1通路Western blot結(jié)果顯示,MKs細(xì)胞缺氧3h、6h、12h后p-p70S6K和p-4EBP1表達(dá)水平均顯著上升,有統(tǒng)計學(xué)差異。p70S6K、4EBP1總蛋白表達(dá)水平不受缺氧處理的影響。Ha Ca T細(xì)胞接受缺氧處理后亦出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。正常情況下,p-p70S6K主要分布在細(xì)胞核中,缺氧處理后熒光染色亮度增強(qiáng),核中點(diǎn)狀陽性染色增加,p-4EBP1染色得到相似的結(jié)果,說明缺氧處理激活角質(zhì)形成細(xì)胞中m TORC1通路。3.2雷帕霉素處理抑制m TORC1活性雷帕霉素可顯著抑制p-p70S6K、p-4EBP1表達(dá)量,與6h組有統(tǒng)計學(xué)差異,說明雷帕霉素可完全抑制缺氧激活的m TORC1。3.3慢病毒干擾抑制m TORC1活性敲減了Raptor的細(xì)胞接受缺氧處理后p-p70S6K和p-4EBP1表達(dá)量無明顯變化,p70S6K、4EBP1總蛋白表達(dá)水平不受缺氧及sh Raptor處理的影響,說明敲減Raptor可切實(shí)有效地抑制m TORC1活性。3.4 m TORC1失活抑制細(xì)胞運(yùn)動性活細(xì)胞工作站結(jié)果顯示,正常細(xì)胞的運(yùn)動軌跡集中,軌跡速度較小,缺氧處理可促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動性。抑制m TORC1活性后,細(xì)胞的運(yùn)動范圍明顯減小,軌跡速度降低,單個角質(zhì)形成細(xì)胞的運(yùn)動能力下降。劃痕實(shí)驗(yàn)也可得到相似的結(jié)果。3.5缺氧處理抑制角質(zhì)形成細(xì)胞AMPK通路缺氧3h、6h、12h后p-AMPK和p-ACC表達(dá)量顯著下降,AMPK、ACC總蛋白表達(dá)水平不受缺氧處理的影響。Ha Ca T細(xì)胞接受缺氧處理后亦出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。這些結(jié)果表明缺氧不影響AMPK的轉(zhuǎn)錄翻譯表達(dá),可顯著抑制AMPK通路活性。3.6激活A(yù)MPK可抑制m TORC1活性Met、AICAR處理可引起p-AMPK、p-ACC表達(dá)水平明顯升高,AMPK通路激活,p-p70S6K和p-4EBP1表達(dá)量顯著下降,m TORC1被明顯抑制,說明激活A(yù)MPK通路可抑制m TORC1。在Ha Ca T細(xì)胞中亦可得到一致結(jié)論。3.7激活A(yù)MPK可抑制細(xì)胞運(yùn)動性活細(xì)胞工作站結(jié)果顯示,缺氧處理可促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動性,細(xì)胞的運(yùn)動范圍、軌跡速度增加。加入Met和AICAR后,細(xì)胞的運(yùn)動范圍減小,軌跡集中,軌跡速度降低。在Ha Ca T細(xì)胞中亦可觀察到一致的現(xiàn)象,說明激活A(yù)MPK會引起單個角質(zhì)形成細(xì)胞的運(yùn)動能力下降。劃痕實(shí)驗(yàn)也可得到類似的結(jié)果。3.缺氧通過抑制AMPK激活m TORC1而促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動能力結(jié)論總結(jié)本課題,可得到以下結(jié)論:1.電場可引起角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)換,使細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫\(yùn)動狀態(tài),促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動能力;這一過程是通過電場抑制PTEN從而激活m TORC1信號通路實(shí)現(xiàn)的。2.電場可引起角質(zhì)形成細(xì)胞從正極向負(fù)極定向遷移,遷移速度增加,這一過程是通過自噬實(shí)現(xiàn)的。電場可引起自噬生成增加,細(xì)胞中溶酶體酸化正常,自噬體和溶酶體順利融合,溶酶體可正常降解底物,自噬流通暢,不存在由于自噬流受損導(dǎo)致的自噬累積,下調(diào)細(xì)胞自噬水平不影響細(xì)胞運(yùn)動的方向性,可顯著抑制細(xì)胞定向遷移速度。3.缺氧可引起角質(zhì)形成細(xì)胞中細(xì)胞運(yùn)動能力顯著增加,這一效應(yīng)的原因是缺氧引起AMPK活性下降從而激活m TORC1通路。4.本課題研究了創(chuàng)面微環(huán)境(電場、缺氧)對創(chuàng)面修復(fù)過程中角質(zhì)形成細(xì)胞啟動和后續(xù)遷移的作用及分子機(jī)制,對揭示創(chuàng)面愈合規(guī)律有重要理論價值,也為臨床創(chuàng)面治療提供新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R64

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7 韓軍濤;王洪濤;胡大海;蔡維霞;湯朝武;;成人不同部位角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)特性比較[A];第八屆全國燒傷外科學(xué)年會論文匯編[C];2007年

8 李文海;Young Mee LEE;Jee Youn KIM;Seokwon KANG;Jin Ho CHUNG;;辣椒素受體介導(dǎo)熱休克誘導(dǎo)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞金屬蛋白酶1的表達(dá)[A];2006中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

9 周愛民;徐麗敏;;TLRs與角質(zhì)細(xì)胞免疫及對病原分子作用機(jī)制[A];2008全國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2008年

10 王平;宋秀祖;許愛娥;畢志剛;崔毓桂;;中波紫外線輻射人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的核因子κB轉(zhuǎn)錄活性研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第十二次全國皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2006年

相關(guān)重要報紙文章 前6條

1 張中橋;血竭能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖[N];中國醫(yī)藥報;2005年

2 張中橋;人角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)有新方法[N];健康報;2005年

3 張中橋;血竭提取物能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖[N];中國中醫(yī)藥報;2005年

4 整理 本報記者 朱國旺;突出創(chuàng)新 緊貼臨床[N];中國醫(yī)藥報;2012年

5 李濟(jì);電場與力學(xué)的綜合題析[N];山西科技報;2003年

6 中國工程院院士 中國醫(yī)科大學(xué)教授 陳洪鐸 中國醫(yī)科大學(xué)長江學(xué)者特聘教授 高興華;如何做好“面子”工程[N];光明日報;2014年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 閆甜甜;創(chuàng)面生物電場和缺氧微環(huán)境對角質(zhì)形成細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2017年

2 楊永生;TRAIL在重癥大皰型藥疹角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡中作用的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

3 黃，

本文編號：1650251