發(fā)布時(shí)間：2018-03-22 05:37

  本文選題：甲�；氖荏w　切入點(diǎn)：神經(jīng)干細(xì)胞　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是脊柱外科的嚴(yán)重疾病之一,年輕人發(fā)病多由于車禍等暴力損傷,而老年人發(fā)病多由于退變的頸椎間盤突出壓迫。損傷后常出現(xiàn)截癱、下肢神經(jīng)功能障礙甚至死亡。由于脊髓自身的神經(jīng)細(xì)胞再生能力有限,SCI發(fā)生后各種治療效果都顯得十分蒼白。椎間盤內(nèi)髓核組織主要由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原構(gòu)成。和神經(jīng)細(xì)胞一樣,軟骨細(xì)胞也存在自身增殖能力有限的缺點(diǎn)。椎間盤在變性后幾乎無法修復(fù),從而失去力學(xué)支撐,突出在椎管內(nèi)對(duì)脊髓產(chǎn)生壓迫。目前以手術(shù)減壓為代表的治療方法無論因暴力還是椎間盤突出所導(dǎo)致的脊髓壓迫都只能提供間接的治療,無法達(dá)到滿意的恢復(fù)效果。因此干細(xì)胞移植成為一種用于治療SCI的新手段。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)具有增殖、遷移以及分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和(或)少突膠質(zhì)細(xì)胞等功能,作為SCI后細(xì)胞移植治療用的主要載體。而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)定向分化為軟骨組織和細(xì)胞的能力,使其成為對(duì)椎間盤變性以及軟骨缺損的細(xì)胞移植治療用的主要載體。但在細(xì)胞移植后,干細(xì)胞的增殖、分化、遷移等轉(zhuǎn)歸問題還有很多因素?zé)o法確定,成為束縛細(xì)胞移植治療效果的瓶頸所在。本文在體外通過甲�；氖荏w(formylpeptide receptors,Fprs)和Ⅱ型膠原的作用下研究對(duì)SCI相關(guān)干細(xì)胞即NSCs和BMSCs的增殖、分化、遷移的影響,為SCI相關(guān)干細(xì)胞移植治療提供基礎(chǔ)理論支持。第一部分：Fprs對(duì)NSCs的增殖、遷移和分化的作用在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的病理狀態(tài)下,NSCs可以遠(yuǎn)距離的遷移到損傷部位,發(fā)揮特定的生物學(xué)效應(yīng),對(duì)損傷起到了一定的修復(fù)作用,但是NSCs如何遷移、到達(dá)局部后如何定向分化為功能性神經(jīng)元,其機(jī)制仍不明了。炎癥細(xì)胞易于通過趨化因子受體而遷移,NSCs是否也通過趨化因子受體而遷移?Fprs屬于G蛋白偶聯(lián)受體,主要在天然免疫和炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用,是經(jīng)典的趨化相關(guān)受體,主要表達(dá)于單核和中性粒細(xì)胞上,也表達(dá)于肝臟等其他組織,近來被發(fā)現(xiàn)同樣表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)如腦組織和脊髓組織中。但Fprs和NSCs之間是否有關(guān)聯(lián)目前尚未見報(bào)道。我們根據(jù)文獻(xiàn)回顧的結(jié)果,設(shè)想Fprs和NSCs有關(guān)聯(lián),并通過免疫熒光、蛋白印跡等方法檢測(cè)出NSCs能夠表達(dá)Fprl和Fpr2。根據(jù)Fprs表達(dá)于NSCs的結(jié)果,通過Fprs的激動(dòng)劑和阻斷劑檢測(cè)其對(duì)NSCs的功能和發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng),發(fā)現(xiàn)Fprs可以促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向分化,并且能夠促進(jìn)NSCs的遷移。本研究可加深Fpr1和Fpr2對(duì)內(nèi)源性NSCs的遷移和分化作用的認(rèn)識(shí),為細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷如腦缺血和SCI開啟了一個(gè)全新的窗口。目的：探討甲�；氖荏w在體外對(duì)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化及遷移的作用。方法：體外提取并培養(yǎng)原代NSCs,對(duì)其性狀進(jìn)行鑒定。分不同干預(yù)組(Fpr1激動(dòng)劑和阻斷劑、Fpr2激動(dòng)劑和阻斷劑)和空白對(duì)照組,分別作用于NSCs3d后,采用CCK-8法檢測(cè)各組對(duì)NSCs活性的影響；免疫熒光法檢測(cè)不同組處理NSCs后,各組與空白對(duì)照組相比,DCX、GFAP、Olig2蛋白表達(dá)量的差異；蛋白印跡(Western Blotting, WB)法檢測(cè)不同組處理NSCs后,各組與空白對(duì)照組相比,DCX蛋白表達(dá)量的差異；形態(tài)學(xué)觀察和transwell法檢測(cè),不同組處理NSCs后,各組與空白對(duì)照組相比,細(xì)胞遷移數(shù)量的差異。結(jié)果：(1)通過免疫熒光和WB法驗(yàn)證了Fpr1和Fpr2存在于NSCs上；(2)通過免疫熒光和WB法驗(yàn)證了Fprl和Fpr2的激動(dòng)劑(fMLF和MMK-1)可促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向分化；(3)通過形態(tài)學(xué)觀察和transwell法驗(yàn)證了Fprl和Fpr2的激動(dòng)劑(fMLF和MMK-1)可促進(jìn)NSCs的遷移；(4)通過CCK-8法驗(yàn)證了Fprl和Fpr2對(duì)NSCs的增殖無影響。第二部分：Ⅱ型膠原對(duì)BMSCs分化為軟骨細(xì)胞的作用椎間盤變性突出的主要原因是軟骨細(xì)胞的變性和細(xì)胞外基質(zhì)的水分丟失,隨著年齡的增長(zhǎng),發(fā)病率隨之增加。由于解剖結(jié)構(gòu)的局限,軟骨細(xì)胞缺乏直接的血運(yùn)循環(huán),損傷后自身修復(fù)或再生的能力非常有限。近年來越來越多的組織工程技術(shù)利用BMSCs的定向分化為軟骨組織和細(xì)胞的能力,并以此構(gòu)建為軟骨組織和細(xì)胞用于對(duì)軟骨缺損的治療已在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用方面都取得了極大的進(jìn)展。但如何能夠讓其定向分化為軟骨細(xì)胞并且發(fā)揮相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)在現(xiàn)目前的研究中還是個(gè)熱點(diǎn)和難點(diǎn)。Ⅱ型膠原(Collagen Ⅱ, col Ⅱ)可由軟骨細(xì)胞分泌合成,具有親和性強(qiáng),能為軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化及功能發(fā)揮近似于體內(nèi)組織發(fā)生發(fā)育的細(xì)胞外基質(zhì)作用的特點(diǎn)。研究表明Ⅱ型膠原在體內(nèi)和體外均可促進(jìn)BMSCs向骨細(xì)胞方向分化,并可促進(jìn)骨缺損的愈合,但其作為軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)BMSCs向軟骨細(xì)胞方向分化的研究少有報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)以Ⅱ型膠原作為細(xì)胞外基質(zhì),體外研究Ⅱ型膠原對(duì)BMSCs向軟骨細(xì)胞方向的分化作用,了解Ⅱ型膠原對(duì)BMSCs分化為軟骨細(xì)胞的影響,以期Ⅱ型膠原作為仿生材料,用于損傷后軟骨的修復(fù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的：探討Ⅱ型膠原在體外促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的定向分化作用。方法：體外原代提取并培養(yǎng)BMSCs,對(duì)其性狀進(jìn)行鑒定。分不同col Ⅱ接種濃度組(25、50、100、200μg/ml)和空白對(duì)照組,分別作用于BMSCs 7.14.21 d,采用CCK-8法檢測(cè)各不同濃度組和時(shí)間點(diǎn)對(duì)BMSCs活性的影響；qPCR法檢測(cè)不同濃度組處理BMSCs后,各濃度組與空白對(duì)照組相比,Collagen Ⅱ、SOX9及Aggrecan mRNA表達(dá)量的差異,免疫熒光法檢測(cè)不同濃度組處理BMSCs后,各濃度組與空白對(duì)照組相比,Collagen Ⅱ、SOX9及Aggrecan蛋白表達(dá)量的差異。結(jié)果：(1)CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示各濃度組在7、14、21 d D(450)值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(2)qPCR檢測(cè)方法顯示21 d后,不同濃度組與空白對(duì)照組比較,Collagen Ⅱ、SOX9及Aggrecan mRNA表達(dá)量均升高(p0.05),以100 μg/ml組最高(p0.01)；14 d時(shí),各濃度組Collagen Ⅱ、SOX9及Aggrecan mRNA以100 μg/ml組上調(diào)最明顯(p0.05),而在7 d時(shí),各組之間三者mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；(3)各濃度組21天時(shí)免疫熒光結(jié)果顯示：在100μg/ml組Collagen Ⅱ、SOX9及Aggrecan蛋白的表達(dá)量較其他各組均明顯上調(diào)(p0.05)。綜上所述：本文通過免疫熒光法、WB法首次證實(shí)了Fprl和Fpr2在NSCs上表達(dá),并發(fā)現(xiàn)Fprl和Fpr2的激動(dòng)劑可以促進(jìn)NSCs的遷移以及向神經(jīng)元方向的分化,而這種作用又可被其阻斷劑所抑制。表明Fprs表達(dá)于NSCs上,并且在NSCs的遷移及分化中起到了重要的作用。通過不同濃度組colⅡ干預(yù)BMSCs 21d后,軟骨細(xì)胞標(biāo)志物(SOX9.Aggrecan及Collagen Ⅱ)mRNA水平和蛋白水平在100 μg/ml組增高最明顯,表明col Ⅱ可促進(jìn)BMSCs向軟骨細(xì)胞方向分化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R651.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 王鐘;陳太邦;王永飛;郭喬楠;趙建華;;樹突狀細(xì)胞通過NT-3/TrkC信號(hào)通路調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞存活的體外研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2013年12期

2 周廣東,王曉云,苗春雷,劉天一,祝聯(lián),劉德莉,崔磊,劉偉,曹誼林;骨髓基質(zhì)細(xì)胞修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)軟骨與骨復(fù)合缺損的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2004年11期

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本文編號(hào)：1647327