本文選題：人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞　切入點(diǎn)：人前交叉韌帶成纖維細(xì)胞　出處：《遵義醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:1)探討人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs)是否具有MSCs的特性及純度。2)比較膠原酶消化法與原位組織塊培養(yǎng)法對分離人前交叉韌帶成纖維細(xì)胞(human anterior cruciate ligament fibroblasts,h ACLFs)的效果;探討使用堿性成纖維生長因子(fibroblast growth factor,FGF)作用于人前交叉韌帶成纖維細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、增殖及相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的效應(yīng)。3)探討體外聯(lián)合生長因子行單純誘導(dǎo)、單層共培養(yǎng)及Transwell共培養(yǎng)定向誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向人前交叉韌帶成纖維細(xì)胞分化的效果。方法:1)取產(chǎn)婦胎盤用胰酶-膠原酶聯(lián)合消化法分離獲得h AMSCs。流式細(xì)胞術(shù)分析鑒定h AMSCs表型分子,CCK-8法檢測h AMSCs增殖活性,免疫熒光染色檢測第3代h AMSCs的CK-19和波形蛋白表達(dá)。分別使用茜素紅、甲苯胺藍(lán)及油紅O染色法檢測7d和21d時(shí)h AMSCs向成骨、成軟骨及成脂細(xì)胞分化后的效果。對成骨細(xì)胞行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性檢測。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測向成骨、成軟骨及成脂細(xì)胞誘導(dǎo)7d、21d時(shí)相關(guān)基因表達(dá)水平。2)分別使用膠原酶消化法和組織塊原位培養(yǎng)法分離h ACLFs,倒置相差顯微鏡觀察兩種方法分離的細(xì)胞形態(tài),CCK-8法檢測兩種分離方法細(xì)胞增殖能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測h ACLFs細(xì)胞表型;使用b FGF培養(yǎng)第3代h ACLFs后,倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性,分別在第7d、10d及14d時(shí)行免疫熒光染色觀察細(xì)胞I、III型膠原,纖維連接蛋白(Fibronectin)及細(xì)胞連接素(Tenascin-C)的表達(dá),實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)檢測韌帶相關(guān)基因及蛋白水平改變。3)聯(lián)合應(yīng)用轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)和b FGF作為誘導(dǎo)劑置于LG-DMEM/F12培養(yǎng)基中。使用第3代h AMSCs和h ACLFs,按照單純誘導(dǎo)、單層共培養(yǎng)及Transwell共培養(yǎng)進(jìn)行分組:單純誘導(dǎo)組(A組)、單純非誘導(dǎo)組(B組)、單層共培養(yǎng)誘導(dǎo)組(C組)、單層共培養(yǎng)非誘導(dǎo)組(D組)、Transwell共培養(yǎng)誘導(dǎo)組(E組)及Transwell共培養(yǎng)非誘導(dǎo)組(F組)。共培養(yǎng)組兩種細(xì)胞密度調(diào)整為104/ml比例為1:1,其中C、D兩組中的h ACLFs在共培養(yǎng)前24h內(nèi)使用Arab-C(終濃度為5μg/ml)以特異性殺滅處于S期的成纖維細(xì)胞。倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)。CCK-8法檢測各組細(xì)胞的增殖活性,分別于7d、14d和21d時(shí):免疫熒光染色觀察各組細(xì)胞I、III型膠原,Fibronectin及Tenascin-C的表達(dá)情況,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各組韌帶相關(guān)基因表達(dá)水平,苦味酸天狼猩紅染色法觀察各組細(xì)胞總膠原表達(dá),Western blot檢測各組細(xì)胞中韌帶相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1)胰酶-膠原酶聯(lián)合消化法可獲得大量可穩(wěn)定增殖的h AMSCs。流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果表明h AMSCs表達(dá)MSCs表型。第3代h AMSCs高表達(dá)波形蛋白,低表達(dá)CK-19。茜素紅染色顯示,成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞存在多個(gè)礦化結(jié)節(jié),細(xì)胞中堿性磷酸酶活性明顯增加;甲苯胺藍(lán)染色顯示,成軟骨誘導(dǎo)后細(xì)胞基質(zhì)中分泌大量的糖胺聚糖;油紅O染色顯示,成脂誘導(dǎo)后,細(xì)胞漿內(nèi)可見脂滴。實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果顯示,成骨、成軟骨及成脂誘導(dǎo)21d后,相關(guān)基因表達(dá)較7d時(shí)明顯增高(P0.05)。2)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示體外分離的h ACLFs表達(dá)成纖維細(xì)胞相關(guān)表型分子。使用兩種分離方法分離的細(xì)胞形態(tài)學(xué)在傳至第2代時(shí)發(fā)生改變,組織塊原位培養(yǎng)法分離的細(xì)胞數(shù)量更多,呈長梭形、雙極樣生長,形態(tài)更加趨近于成纖維細(xì)胞,膠原酶消化法分離的細(xì)胞數(shù)量較少,呈短棒、不規(guī)則狀。組織塊原位培養(yǎng)法分離的h ACLFs增殖能力顯著高于膠原酶消化法(P0.05)。b FGF作用于第3代h ACLFs后,細(xì)胞增殖能力顯著提高(P0.05),細(xì)胞呈長梭形、成纖維樣生長且極性明顯。免疫熒光染色顯示使用b FGF培養(yǎng)的細(xì)胞其I、III型膠原,Fibeonectin和Tenascin-C表達(dá)有顯著提高;PCR結(jié)果顯示b FGF培養(yǎng)組中I、III型膠原、Fibronectin、Tenascin-C,基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、賴氨酰氧化酶-1(lysyl oxidase-1,LOX-1)的m RNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示加入b FGF培養(yǎng)的h ACLFs其I、III型膠原蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組(P0.05)。3)使用誘導(dǎo)因子的各組其細(xì)胞增殖水平顯著高于未使用誘導(dǎo)因子組(P0.05)。免疫熒光染色顯示I、III型膠原,Fibeonectin和Tenascin-C表達(dá)水平隨時(shí)間延長而增加,使用誘導(dǎo)因子各組蛋白表達(dá)水平高于非誘導(dǎo)組,其中Transwell共培養(yǎng)誘導(dǎo)組于21d時(shí)蛋白表達(dá)較其他組更高。PCR結(jié)果顯示I、III型膠原、Fibronectin、Tenascin-C,MMP-2、LOX-1、α-肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的m RNA表達(dá)水平于14d和21d時(shí)顯著上調(diào)(P0.05),Transwell共培養(yǎng)誘導(dǎo)組于21d時(shí),I、III型膠原、MMP-2、LOX-1、α-SMA其表達(dá)高于其他組。Western blot結(jié)果顯示Transwell共培養(yǎng)誘導(dǎo)組于21d時(shí)I、III型膠原蛋白表達(dá)水平顯著高于其他組(P0.05)。苦味酸天狼猩紅染色結(jié)果顯示21d時(shí)Transwell共培養(yǎng)誘導(dǎo)組總膠原水平最高,較其他組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有MSCs的特征并且可以向成骨細(xì)胞,軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞的潛能,可選作為組織工程學(xué)的種子細(xì)胞。2)體外成功分離h ACLFs,并表達(dá)成纖維細(xì)胞的表型分子;證實(shí)組織塊原位培養(yǎng)法分離的細(xì)胞增殖效率更高,獲得細(xì)胞數(shù)量更多,形態(tài)學(xué)更趨近于成纖維細(xì)胞。3)b FGF可提高h(yuǎn) ACLFs體外增殖能力,細(xì)胞形態(tài)更趨向成纖維細(xì)胞特性,韌帶相關(guān)特異性基因及蛋白表達(dá)增加。4)b FGF聯(lián)合TGFβ-1可促進(jìn)h AMSCs向h ACLFS分化;單層共培養(yǎng)與Transwell共培養(yǎng)較單純誘導(dǎo)方法,細(xì)胞分化效果更加明顯;在基因、蛋白及膠原分泌水平上,Transwell共培養(yǎng)方式比單層共培養(yǎng)誘導(dǎo)效果更強(qiáng),且Transwell共培養(yǎng)方式誘導(dǎo)的細(xì)胞與正常水平的h ACLFs更為趨近;Transwell共培養(yǎng)可更好的模擬體內(nèi)環(huán)境,聯(lián)合使用b FGF和TGFβ-1可提高h(yuǎn) AMSCs向h ACLFs分化效率及誘導(dǎo)效果。Transwell共培養(yǎng)與生長因子的聯(lián)合應(yīng)用為構(gòu)建組織工程化韌帶提供了新的方法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R687.4

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6 張誠s，

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