本文選題：骨肉瘤　切入點(diǎn)：免疫治療　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：骨肉瘤是最常見的原發(fā)于骨組織的惡性腫瘤,多見于青少年,具有局部侵犯和早期發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。盡管采用最新的新輔助化療+手術(shù)+術(shù)后化療的治療策略后患者的5年生存率能達(dá)到60-80%左右,然而一旦發(fā)生化療耐藥或復(fù)發(fā),則預(yù)后極差。另外,骨肉瘤的一線化療方案核心藥物(甲氨蝶呤、阿霉素、順鉑,MAP方案)已延用幾十年之久,臨床上對化療耐藥的患者手段十分有限。因此,若能尋找一個除了常規(guī)手術(shù)、化療、放療之外的治療方法,將會是對常規(guī)療法的極大補(bǔ)充。免疫治療并被譽(yù)為是除三種常規(guī)療法之外的"第四種療法"。過繼性細(xì)胞輸注治療是重要的免疫治療手段之一,近期在臨床試驗(yàn)中尤其是對白血病取得了極大突破。然而相比較于白血病,絕大多數(shù)實(shí)體腫瘤都缺少特異性強(qiáng)、表達(dá)率高的免疫治療靶點(diǎn),而且實(shí)體腫瘤的腫瘤微環(huán)境也從多個方面阻止效應(yīng)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的攻擊,骨肉瘤亦有這些特點(diǎn)。因此,如何對骨肉瘤進(jìn)行安全、有效的過繼性細(xì)胞輸注免疫治療是時下的難點(diǎn)。腫瘤/睪丸抗原幾乎只存在于惡性腫瘤和免疫逃逸區(qū),是特異性很強(qiáng)的腫瘤特異性抗原。但其在骨肉瘤上表達(dá)率差別很大,且常常處于高甲基化狀態(tài)導(dǎo)致表達(dá)降低乃至沉默。另外,腫瘤細(xì)胞可以通過異常的高甲基化使諸多抑癌基因沉默,并影響某些與免疫反應(yīng)直接相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)。我們使用去甲基化藥物地西他濱對骨肉瘤細(xì)胞系進(jìn)行治療后,發(fā)現(xiàn)腫瘤/睪丸抗原在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)得到顯著提高,且提高的抗原表達(dá)能成功被體外培養(yǎng)的腫瘤/睪丸抗原特異性CD8+T細(xì)胞識別。另外,去甲基化治療本身對骨肉瘤細(xì)胞有殺傷作用;在聯(lián)合T細(xì)胞治療后,殺傷率得到進(jìn)一步提高。我們隨后使用人骨肉瘤細(xì)胞系在免疫缺陷鼠建立皮下荷瘤模型,對小鼠進(jìn)行去甲基化治療和人源CD8+T細(xì)胞輸注治療,并使用小動物活體成像系統(tǒng)監(jiān)測輸注入小鼠體內(nèi)的T細(xì)胞分布。我們發(fā)現(xiàn)只有在經(jīng)過去甲基化治療的小鼠中,腫瘤/睪丸抗原特異性CD8+T細(xì)胞才能歸巢至腫瘤區(qū)域。治療過程中測量腫瘤大小、治療結(jié)束后腫瘤稱重均提示聯(lián)合治療能顯著抑制腫瘤生長。但去甲基化治療單藥治療對在體的骨肉瘤效果不明顯,只有在聯(lián)合T細(xì)胞輸注后才顯示出抗腫瘤效果。我們同時還使用鼠骨肉瘤細(xì)胞系在免疫健全鼠建立原位模型,對小鼠進(jìn)行去甲基化治療,檢測去甲基化治療對腫瘤局部免疫反應(yīng)的影響。我們發(fā)現(xiàn)去甲基化治療促進(jìn)了腫瘤灶的淋巴細(xì)胞浸潤,并提高了腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞的活性,且這些效果具有劑量依賴性。我們進(jìn)一步探索去甲基化治療促進(jìn)腫瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤的可能機(jī)制時,發(fā)現(xiàn)可能與趨化因子CXCL12的表達(dá)量有關(guān)。骨肉瘤存在著高甲基化的CXCL12,從而導(dǎo)致CXCL12表達(dá)量降低、T細(xì)胞歸巢減弱。而去甲基化治療能提高骨肉瘤的CXCL12表達(dá),為T細(xì)胞歸巢創(chuàng)造條件。綜上,本研究表明去甲基化治療能促進(jìn)骨肉瘤局部的免疫反應(yīng),并能誘導(dǎo)腫瘤/睪丸抗原特異性CD8+T細(xì)胞趨化、識別骨肉瘤,進(jìn)而有效地控制骨肉瘤生長。
[Abstract]:Osteosarcoma is the most common primary bone malignant tumor, more common in young people, occurrence of distant metastasis with local invasion and early. Despite the use of neoadjuvant chemotherapy plus surgery + patients new treatment strategies after chemotherapy in patients after 5 years survival rate can reach about 60-80%, but once the occurrence of resistance to chemotherapy or recurrence, the prognosis is poor. In addition, first-line chemotherapy for osteosarcoma core drugs (methotrexate, doxorubicin, cisplatin, MAP) has been used for decades, clinical resistance to chemotherapy in patients with very limited means. Therefore, if we can find one in addition to conventional surgery, chemotherapy, radiotherapy treatment outside, will is a great complement to conventional therapies. Immunotherapy and known as the three is in addition to conventional therapy besides "fourth therapy". Adoptive cell transfusion therapy is one of the important means of immunotherapy, recently in clinical trial In the experiment of leukemia especially made great breakthrough. However, compared to the vast majority of solid tumors, leukemia, lack of specificity, the expression of immune therapeutic target rate is high, and the solid tumor tumor microenvironment also from many aspects of blocking immune cells to tumor cells of osteosarcoma have these attacks characteristics. Therefore, how to carry out the safety of osteosarcoma, effective adoptive cell immunotherapy infusion is nowadays difficult. The cancer / testis antigens found almost exclusively in malignant tumor and immune escape, is tumor specific strong specificity antigen expression in osteosarcoma. But the rate difference is very big, and often in high methylation leads to reduced expression and silence. In addition, tumor cells can make many aberrantly hypermethylated tumor suppressor gene silencing, and the influence of some immune response is directly related to the expression of the protein. We used to go on osteosarcoma cell line were treated with demethylating agent decitabine, tumor / testis antigen expression in osteosarcoma cells was significantly increased, and the increase in the expression of antigen can be successfully cultured in vitro cancer / testis antigen specific CD8+T cell recognition. In addition, demethylation treatment itself the killing effect of osteosarcoma cells; in combined with T cells after the treatment, the killing rate can be further improved. We then use the human osteosarcoma cell lines established subcutaneous tumor model in immunodeficient mice, the mice were demethylation therapy and human CD8+T cell infusion therapy, T cell distribution and the use of small animal imaging monitoring system infused into mice. We found that only through methylation treatment in mice, cancer / testis antigen specific CD8+T cells to tumor homing to the area. During the treatment of swelling measurement Tumor size, tumor weight after treatment indicated that combined treatment could significantly inhibit tumor growth. But demethylation treatment of osteosarcoma in the single drug treatment effect was not obvious, only in combination with T cell infusion showed antitumor effect. We also use the rat osteosarcoma cell line in immunocompetent the establishment of rat orthotopic model of mice by demethylation treatment, detection of demethylation treatment of local tumor response. We found that demethylation therapy promotes tumor infiltrating lymphocytes, and increased CD8+T activity in tumor cells, and the effect is dose dependent. We further explore the demethylation treatment of possible mechanisms in promoting lymphocyte infiltration of the tumor, and may find expression of chemokine CXCL12 on osteosarcoma. There exist hypermethylation of CXCL12, resulting in the expression of CXCL12 Decreased T cell homing weakened. The demethylation treatment can improve the expression of CXCL12 in osteosarcoma, and create conditions for the homing of T cells. In conclusion, this study shows that demethylation therapy can promote the immune response of osteosarcoma locally, and can induce the cancer / testis antigen specific CD8+T cell chemotaxis, recognition of osteosarcoma, and to effectively control the growth of osteosarcoma.

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R738.1

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9 朱U，

本文編號：1585788