本文選題：一氧化碳　切入點(diǎn)：心肌冷缺血再灌注損傷　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的終末期心臟病的治療方法中,心臟移植無論是從病人的治愈率還是病人的術(shù)后生存時(shí)間來看,都是無可非議的,甚至是最好的。等待接受心臟移植的患者數(shù)量每年都在增加。供者來源少,受者數(shù)量卻增加,對(duì)供心的要求就越來越急迫。常用心臟保存液保存離體心臟限制在4-6 h,離體供心保存時(shí)間短,限制了心臟移植手術(shù)的開展。通過改良保存液的成分,如加入鈣離子、抗氧化劑等可以減輕保存過程中對(duì)供心的損傷,但效果仍不理想。如若找到一種全新的離體器官(心臟)保存方法,在保證保存質(zhì)量的同時(shí)大大延長保存時(shí)間,可緩解目前供心緊缺的現(xiàn)狀,造福廣大復(fù)雜先天性心臟病和終末期心臟病的患者。本實(shí)驗(yàn)課題采用一氧化碳(Carbon monoxide,CO)高壓干燥保存這一全新的器官保存方法,用以保存小鼠離體供心,觀察一氧化碳和氧氣混合氣體的高壓干燥保存方式是否優(yōu)于目前常用的康斯特保護(hù)液(HistidiBe Tryptophan Ketoglurate Solution,HTK液)浸泡保存,并對(duì)該保存方式的可能作用機(jī)制進(jìn)行探討。方法一SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠,84只。供體鼠4-6周齡,體重(21±2)g,共48只;受體鼠6-8周齡,體重(29±2)g,共36只,所有實(shí)驗(yàn)用鼠均購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,飼養(yǎng)在屏障環(huán)境內(nèi)。供體鼠隨機(jī)分為4組,每組12只：空白對(duì)照組、 即刻移植組、HTK浸泡保存24移植組(HTK組)及CO高壓干燥保存24 h移植組(CO組)。受體鼠隨機(jī)分為3組,每組12只：即刻移植受體組、HTK受體組及高壓干燥受體組。供體小鼠處理：小鼠術(shù)前均不禁食禁水,稱重后,10%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,麻醉成功后剪開腹壁,下腔靜脈予以暴露,4℃肝素水1 mL(100 u/mL),經(jīng)下腔靜脈注射。剪開胸壁及膈肌,向心臟以1 mL注射器緩慢注射高鉀停搏液,直至心臟完全停止跳動(dòng)。分離心臟和肺臟周圍組織,將心肺聯(lián)合取下并迅速放入4℃裝有肝素生理鹽水的塑料培養(yǎng)皿中。供心處理：空白對(duì)照組取心后不做移植,馬上取材進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)；HTK保存組則是15 mL 4℃HTK液中保存24 h；高壓干燥保存組則是處理完供心后懸掛于已預(yù)冷至4℃的干燥高壓保存罐內(nèi)。往罐內(nèi)注入800 hPa的C0及3,200 hPa的02,密封后將罐置于4℃冰箱中保存24 h,注意高壓灌內(nèi)氣體變化并及時(shí)補(bǔ)充氣體。同系小鼠頸部異位心臟移植模型建立：受體鼠6-8周齡,按供體鼠處理方法麻醉滿意后仰臥位固定。采用改良cuff方法進(jìn)行小鼠異位心臟移植術(shù)。分離靜脈殘端多于組織,將靜脈殘端修正后穿入靜脈套管,然后后翻呈袖套樣套于套管壁上,10-0絲線套扎固定。移植后觀察供心2h,記錄供心復(fù)跳情況質(zhì)地及顏色變化等。記錄供心復(fù)跳率；依據(jù)復(fù)灌后供心的收縮強(qiáng)度、顏色及供心的硬度進(jìn)行移植物活力評(píng)分,2h觀察完畢后,縫皮,受體鼠置于電熱毯保溫、獨(dú)籠飼養(yǎng)。術(shù)后供心取樣檢測(cè)：空白對(duì)照組小鼠取心后即刻送檢,即刻移植組、HTK保存組、高壓干燥保存組于移植后24h取心送檢。蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosinstaining,HE)染色法進(jìn)行組織切片的染色,觀察切片病理變化情況,缺口末端標(biāo)記法(Terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,Tunnel)檢測(cè)凋亡細(xì)胞,進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)(高倍顯微鏡下),免疫印跡法(Western-blot,WB)檢測(cè)自噬標(biāo)志性蛋白微管相關(guān)蛋白1-輕鏈3-Ⅱ(Microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ, LC3-Ⅱ)及B細(xì)胞白血病／淋巴瘤-2(B cell lymphoma/leukemia-2, Bcl-2)蛋白。結(jié)果供心移植后復(fù)跳率結(jié)果為：即刻移植組有9只復(fù)跳(n=12)、HTK保存組有1只復(fù)跳(n=12),高壓干燥保存組有8只復(fù)跳(n=12),復(fù)跳率結(jié)果分別為75%、8.3%、66.7%,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(I2=12.667,P=0.0020.01),調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)a'=a/3=0.0167,多樣本間行兩兩比較,即刻移植組與高壓干燥保存組復(fù)跳率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.6530.0167),高壓干燥保存組復(fù)跳率明顯高于HTK液保存組(P=0.0030.0167),即刻移植組復(fù)跳率明顯高于HTK保存組(P=0.0010.0167)。各組移植物活力評(píng)分分別用中位數(shù)、第1四分位數(shù)(P25%)及第3四分位數(shù)(P75%)表示,即刻移植組、HTK保存組及高壓干燥保存組活力評(píng)分分?jǐn)?shù)為4.5(4.0-4.5)、0.75(0.5-1.0)、2.5(2.0-2.875),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。與即刻移植組移植物功能評(píng)分比較,HTK保存組、高壓干燥保存組降低(P0.01)。高壓干燥保存組移植物功能評(píng)分高于HTK保存組(P0.01)。Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)結(jié)果：空白對(duì)照組、即刻移植組、HTK組、CO組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量分別為(0.125±0.03)、(1.243±0.20)、(0.157±0.06)、(0.867±0.18),組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=187,P0.05)。組間行兩兩比較,LC3-Ⅱ蛋白在即刻移植組表達(dá)最高,空白對(duì)照組和HTK組相比,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),CO組表達(dá)高于HTK組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)�？瞻讓�(duì)照組、即刻移植組、HTK組、CO組Bcl-2蛋白表達(dá)量分別為(0.187±0.018)、(2.065±0.319)、(0.261±0.075)、(2.058±0.292),組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=280,P0.05)。Bcl-2蛋白在即刻移植組表達(dá)最高,CO組和即刻移植組相比,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),CO組表達(dá)高于HTK組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色結(jié)果,空白對(duì)照組心肌細(xì)胞染色均一,間質(zhì)未見水腫,即刻移植組供心,心肌結(jié)構(gòu)完整,間質(zhì)稍水腫但無炎細(xì)胞浸潤和紅細(xì)胞滲出,HTK組供心,心肌細(xì)胞變性、細(xì)胞間質(zhì)水腫,間質(zhì)可見大量炎細(xì)胞浸潤和紅細(xì)胞滲出,CO組供心細(xì)胞排列致密,結(jié)構(gòu)基本完整,染色比較均勻,間質(zhì)可見少量的中性粒細(xì)胞浸潤,無明顯的紅細(xì)胞滲出。Tunnel染色顯示,光鏡下空白對(duì)照組心肌細(xì)胞染色均一淡染,未發(fā)現(xiàn)異常核。Tunnel標(biāo)記的陽性細(xì)胞細(xì)胞核呈綠色,即刻移植組心肌細(xì)胞染色均勻,未發(fā)現(xiàn)綠色陽性細(xì)胞,HTK組可見大量綠色陽性凋亡細(xì)胞,明顯較CO組增加�？瞻讓�(duì)照組、即刻移植組、HTK組、CO組四組凋亡細(xì)胞指數(shù)分別1.08±0.56、2.13±1.71、26.72±5.23、5.04±1.77,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=209,P0.01)。組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)：與空白對(duì)照組、即刻移植組比較,HTK、CO兩組凋亡細(xì)胞指數(shù)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)； CO組凋亡指數(shù)較HTK組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；空白對(duì)照組、即刻移植兩組間凋亡細(xì)胞指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。方法二SPF級(jí)C57BL/6小鼠,雄性,60只。供體鼠4-6周齡,36只,體質(zhì)量21±2 g；受體鼠6-8周齡,24只,體質(zhì)量29±2 g,均購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,飼養(yǎng)在屏障環(huán)境內(nèi),供體鼠隨機(jī)分為3組,每組12只,為空白對(duì)照組、HTK浸泡保存16h移植組(HTK組)及CO高壓干燥保存16 h移植組(CO組)。受體鼠隨機(jī)分為2組,每組12只,分組如下：HTK保存受體組及高壓干燥保存受體組。供體小鼠處理：小鼠術(shù)前均不禁食禁水,稱重后,10%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,麻醉成功后剪開腹壁,下腔靜脈予以暴露,4℃肝素水1 mL(100 u/mL)經(jīng)下腔靜脈注射。剪開膈肌及胸壁,向心臟以1 mL注射器緩慢注射高鉀停搏液,直至心臟完全停止跳動(dòng)。分離心臟和肺臟周圍組織,將心肺聯(lián)合取下并迅速放入4℃裝有肝素生理鹽水的塑料培養(yǎng)皿中。供心處理空白對(duì)照組取心后不做移植,馬上取材進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)；HTK保存組則是15 mL 4℃HTK液中保存16 h；高壓干燥保存組則是處理完供心后懸掛于已預(yù)冷至4℃的干燥高壓保存罐內(nèi)。往罐內(nèi)注入400 hPa的CO及1,600 hPa的02,密封后將罐置于4℃冰箱中保存16 h,注意高壓灌內(nèi)氣體變化并及時(shí)補(bǔ)充氣體。同系小鼠心臟腹部異位移植模型建立：6-8周齡小鼠作為受體鼠,麻醉滿意后仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上,顯微鑷游離腹主動(dòng)脈血管及下腔靜脈血管,顯微血管夾夾閉所移植部位的血管的近心端及遠(yuǎn)心端。將供體心臟放在受體小鼠腹腔右側(cè),10-0尼龍線將受體小鼠腹主動(dòng)脈與供體心的升主動(dòng)脈作端側(cè)吻合,受體鼠下腔靜脈與供體心肺動(dòng)脈血管作端側(cè)吻合。移植后的供心2h,記錄供心復(fù)跳情況質(zhì)地及顏色變化等。依據(jù)開放血管夾恢復(fù)血流后供心的搏動(dòng)情況來記錄供心復(fù)跳率；進(jìn)行移植物活力評(píng)分。2h觀察完畢后,縫皮,受體鼠置于電熱毯保溫、獨(dú)籠飼養(yǎng)。術(shù)后供心取樣檢測(cè)：空白對(duì)照組小鼠取心后即刻送檢,HTK保存組、高壓干燥保存組于移植后24 h取心送檢。取三組供心的心肌組織,蘇木精—伊紅HE染色法進(jìn)行組織切片的染色,觀察切片中心肌細(xì)胞排列、間質(zhì)水腫及炎細(xì)胞浸潤情況,Tunnel檢測(cè)凋亡細(xì)胞,進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)(高倍顯微鏡下),并比較四組心肌細(xì)胞的凋亡程度,行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR檢測(cè)腫瘤壞死因子-a(Tnecrosis factor α,TNF-a),白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,JL-1β),白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6),,細(xì)胞間黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)和白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10,ILI-10)的表達(dá),推斷高壓干燥保存法的可能作用機(jī)制。結(jié)果供心移植后復(fù)跳率結(jié)果為：HTK保存組有3只復(fù)跳(n=12),高壓干燥保存組有10只復(fù)跳(n=12),復(fù)跳率結(jié)果分別為25%、83.3%,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0120.05),CO組供心復(fù)跳率高于HTK組。移植物活力評(píng)分結(jié)果,各組移植物活力評(píng)分分別用中位數(shù)、第1四分位數(shù)(P2s%)及第3四分位數(shù)(P75%)表示,HTK保存組及高壓干燥保存組活力評(píng)分分?jǐn)?shù)為1.30(0.963-1.54)、3.50(3.125-3.938),兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn),CO組移植物功能優(yōu)于HTK組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.447,P0.01)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果HTK組、CO組TNF-a的基因表達(dá)的相對(duì)單位為(5.095±0.421)、(3.602±0.219),HTK組表達(dá)較CO組高,t=10.902,P0.01,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HTK組、CO組IL-1p基因表達(dá)的相對(duì)單位為(4.924±0.825)(2.891±0.278),HTK組表達(dá)較CO組高,t=8.084,P0.01,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HTK組、CO組IL-6基因表達(dá)的相對(duì)單位為(5.345±0.667)、(3.033±0.320),HTK組表達(dá)較CO組高,t=10.821,P0.01,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HTK組、CO組ICAM-1基因表達(dá)的相對(duì)單位為(4.892±0.817)、(3.073±0.524),HTK組表達(dá)較CO組高,t=6.493,P0.01,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HTK組、CO組IL-10基因表達(dá)的相對(duì)單位為(3.617±0.419)、 (7.190±1.048),CO組表達(dá)較HTK組高,t=10.971,P0.01,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色結(jié)果,空白對(duì)照組心肌細(xì)胞染色均一,結(jié)構(gòu)完整,HTK組供心,心肌細(xì)胞變性,間質(zhì)可見大量炎細(xì)胞浸潤和紅細(xì)胞滲出,CO組供心細(xì)胞排列致密,結(jié)構(gòu)基本完整,間質(zhì)可見少量的中性粒細(xì)胞浸潤,無明顯的紅細(xì)胞滲出。Tunnel染色顯示,光鏡下空白對(duì)照組心肌細(xì)胞染色均一淡染,未發(fā)現(xiàn)異常核。Tunnel標(biāo)記的陽性細(xì)胞細(xì)胞核呈綠色,HTK組可見大量綠色陽性凋亡細(xì)胞,明顯較CO組增加。空白對(duì)照組、HTK組、CO組三組凋亡細(xì)胞指數(shù)分別1.36±0.30、14.18±4.75、6.61±1.06,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=62.963,P0.01)。組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；與空白對(duì)照組比較,HTK組、CO兩組凋亡細(xì)胞指數(shù)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)； CO組凋亡指數(shù)較HTK組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論綜上所述,高壓干燥的保存方式是一種有效的心臟保存方法,該方法通過CO作用于心肌細(xì)胞,發(fā)揮抗炎癥、抗凋亡的細(xì)胞保護(hù)作用,使心肌細(xì)胞中Bcl-2蛋白上調(diào),抑制心肌細(xì)胞凋亡,該保存方法亦可能利于冷缺血過程中自噬作用的發(fā)揮,通過清除無用的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)為心肌細(xì)胞提供能量,達(dá)到保護(hù)心肌的作用,但其在供心保存過程中的機(jī)制仍值得進(jìn)一步探討。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R654.2

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本文編號(hào)：1569139