本文關(guān)鍵詞： 落新婦苷 缺血再灌注 肝臟 自噬　出處：《揚州大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的1、探索大鼠正常肝臟和缺血再灌注損后肝臟中的細胞自噬現(xiàn)象。2、探討落新婦苷對大鼠肝臟缺血再灌注損傷(HIRI)預(yù)處理的作用機制,觀察保護效應(yīng)與自噬水平的變化,為肝臟缺血再灌注損傷的治療提供一定的依據(jù)。方法1、實驗分組:54只健康SD大鼠(均為雄性,體重大約250～300g)隨機分為3組,分別為落新婦苷預(yù)處理組、HIRI組(缺血再灌注組)以及Sham組(假手術(shù)組),每組18只;再按術(shù)后4h、8h、16 h三個時間段,每個時間段各6只。2、建立模型:各組大鼠術(shù)前12 h禁食、不禁水,落新婦苷預(yù)處理組,術(shù)前7天開始每日上午08:00給予落新婦苷腹腔按照劑量為每千克大鼠40毫克注射,HIRI組和Sham組給予同樣劑量生理鹽水每日上午08:00腹腔注射。落新婦苷預(yù)處理組和HIRI組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后,行腹部正中切口,逐層切開,打開腹膜進入腹腔,暴露肝臟,找到第一肝門;游離支配肝左、中葉的脈管,并用無創(chuàng)血管夾夾閉脈管的共干,觀察肝臟顏色的變化,肝左、中葉的顏色變深,即已建立約70%的肝臟缺血模型;夾閉時間大約45分鐘,重新恢復(fù)血流,逐層縫合切口。Sham組僅行上腹部正中切口,逐層進入腹腔后輕輕游離肝門,無需夾閉脈管,直接縫合關(guān)腹。3、樣本的采集和觀察指標的測定:分別于手術(shù)后4h、8h、16h取抽取下腔靜脈血及大鼠肝左外葉作為標本,檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST),光學顯微鏡下觀察Sham組、HIRI組及落新婦苷組不同時間段的肝細胞顯微結(jié)構(gòu)變化;Western Blot分析肝組織中LC3、Beclin-1的表達;電鏡下觀察肝臟組織內(nèi)自噬小體數(shù)量情況。結(jié)果1、54只健康SD大鼠手術(shù)后都能在一定時間內(nèi)復(fù)蘇,維持有效的呼吸與心跳,并且能相應(yīng)活動。2、術(shù)后肝功能主要是檢測血清ALT和AST水平的變化,HIRI組的ALT和AST水平較假手術(shù)組明顯升高,而落新婦苷組與HIRI組相比明顯降低,且有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3、術(shù)后肝組織HE染色顯示Sham組肝小葉、肝匯管區(qū)結(jié)構(gòu)顯示清晰,肝細胞形態(tài)正常,無炎性細胞浸潤。術(shù)后4h時,HIRI組中肝細胞索排列出現(xiàn)紊亂,部分肝細胞出現(xiàn)腫脹,并有炎性細胞浸潤;落新婦苷組中只見少許肝細胞水腫。術(shù)后8h HIRI組,肝細胞索排列嚴重紊亂,肝匯管區(qū)結(jié)構(gòu)顯示模糊,出現(xiàn)肝細胞的大片壞死;落新婦苷組肝細胞只見輕度水腫,少量炎性細胞浸潤,肝匯管區(qū)結(jié)構(gòu)顯示清晰。術(shù)后16h HIRI組中肝細胞損傷減輕,細胞形態(tài)較前有改善;落新婦苷組中肝細胞的形態(tài)基本正常。4、通過Western blotting檢測術(shù)后肝組織中LC3、Beclin-1蛋白的表達,與相Sham組比較,HIRI組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ灰度值比值及Beclin-1灰度值在術(shù)后各個時段均明顯升高且有統(tǒng)計學意義(P0.05),在8h時達到高峰,在16h時下降。落新婦苷組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1灰度值比值在術(shù)后各個時段均較HIRI組下降,且有統(tǒng)計學意義(P0.05);結(jié)果提示落新婦苷在術(shù)后各個時段均可以減輕LC3-Ⅲ/LC3-Ⅰ蛋白比值和Beclin-1蛋白的表達。5、電鏡下觀察再灌注8小時三組大鼠肝臟的自噬小體的數(shù)量,結(jié)果顯示,與Sham組(0.69±0.04)大鼠肝臟的平均自噬小體數(shù)量相比,HIRI組(7.12±0.60)大鼠肝臟的平均自噬小體數(shù)量有所增多,且有統(tǒng)計學意義(P0.05);與HIRI組大鼠肝臟的平均自噬小體數(shù)量相比,落新婦苷組(3.68±0.42)大鼠肝臟的平均自噬小體數(shù)量有所下降,且有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論結(jié)果顯示,經(jīng)過落新婦苷預(yù)處理后,大鼠肝臟缺血再灌注損傷后血清轉(zhuǎn)氨酶水平明顯下降,光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)落新婦苷組較HIRI組肝細胞形態(tài)及炎癥浸潤情況等明顯減輕。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ灰度值比值以及Beclin-1灰度值在術(shù)后各個時段均較HIRI組下降,提示落新婦苷可減輕術(shù)后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值和Beclin-1蛋白的表達,表明落新婦苷預(yù)處理可降低大鼠HIRI后的自噬水平。電鏡下的結(jié)果顯示正常大鼠術(shù)后也存在少量自噬小體,HIRI組自噬小體最多,而落新婦苷組肝臟細胞的自噬小體數(shù)量比HIRI組有所減少,這也證實了落新婦苷預(yù)處理確實降低了大鼠HIRI后的自噬水平。綜上所述,正常大鼠肝臟也存在自噬現(xiàn)象,落新婦苷預(yù)處理可減輕大鼠HIRI,其作用機制可能與下調(diào)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值及Beclin-1蛋白的水平,從而抑制自噬有關(guān)。本實驗從自噬的角度來分析落新婦苷對大鼠HIRI的保護作用,對HIRI的臨床治療提供了相關(guān)的實驗依據(jù)。
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【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R657.3

【參考文獻】

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本文編號：1551628