本文關(guān)鍵詞： 巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞 巨噬細(xì)胞極性 BDNF 脊髓損傷 炎癥反應(yīng)　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：大量研究證實脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain Derived Neurotrophic Factor,BDNF)可以通過多種機(jī)制發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用,進(jìn)而抑制神經(jīng)元的凋亡,促進(jìn)軸突再生,調(diào)節(jié)突觸傳遞,增強(qiáng)神經(jīng)興奮性,促進(jìn)前體細(xì)胞的增殖和髓鞘再生。盡管有研究顯示BDNF具有抗炎抗氧化作用,并且對免疫反應(yīng)具有一定的調(diào)節(jié)作用,但SCI后BDNF對炎癥反應(yīng)的影響尚不明確。本課題通過系列研究證實SCI后損傷局部過表達(dá)BDNF可以明顯改善炎癥微環(huán)境,抑制促炎因子(IL-1β,TNF-a)的表達(dá)并上調(diào)抑炎因子(IL-10,IL-13)的表達(dá),同時可以促進(jìn)損傷區(qū)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞表型由M1向M2轉(zhuǎn)變。此外,BDNF對炎癥反應(yīng)的調(diào)解在一定程度上增強(qiáng)了其神經(jīng)保護(hù)作用并顯著促進(jìn)了運(yùn)動功能的恢復(fù)。第一部分:SCI后損傷中心處注射Lenti-BDNF載體成功過表達(dá)并以轉(zhuǎn)染損傷局部炎癥細(xì)胞為主材料與方法1.Lenti-BDNF載體構(gòu)建;BDNF基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增的BDNF基因片段交換入線性化GV208表達(dá)載體,獲得GV208-BDNF慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。陽性克隆菌落行PCR鑒定,對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序后將其與慢病毒包裝系統(tǒng)共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝,最后通過Real-time PCR法進(jìn)行病毒滴度檢測。2.C57BL/6脊髓損傷模型建立;通過建立兩種常用SCI動物模型,T10節(jié)段背側(cè)半切模型和T10節(jié)段動脈夾夾傷模型。選擇適合于本課題慢病毒載體注射的SCI模型。3.損傷中心處Lenti-EGFP和Lenti-BDNF注射以及轉(zhuǎn)染細(xì)胞種類的鑒定;通過立體定向儀以及漢密爾頓微量進(jìn)樣器向損傷中心處注射慢病毒載體,通過對損傷節(jié)段進(jìn)行CD11b和GFAP免疫熒光染色,明確慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞種類。4.各組損傷節(jié)段BDNF表達(dá)水平檢測;慢病毒載體注射后第4天,通過ELISA檢測各組損傷節(jié)段(自損傷中心處向頭側(cè)和尾側(cè)各1.5mm)BDNF的表達(dá)水平。結(jié)果1.GV208-BDNF過表達(dá)質(zhì)粒的陽性克隆鑒定顯示測序結(jié)果與目標(biāo)序列比對完全一致。慢病毒包裝后Real time PCR法測定病毒滴度為2.00E+8TU/ml。2.T10節(jié)段背側(cè)半切模型和動脈夾夾傷模型都可以破壞小鼠的皮質(zhì)脊髓束(CST)并造成后肢運(yùn)動功能的喪失,但夾傷模型能夠更好的保護(hù)硬脊膜,減少病毒流失,更適合本課題研究。3.慢病毒注射后4天(脊髓損傷后第7天),共聚焦結(jié)果顯示EGFP細(xì)胞廣泛分布在損傷中心處,并且在轉(zhuǎn)染EGFP的細(xì)胞中,CD11b陽性細(xì)胞的百分比分在lenti-EGFP和Lenti-BDNF組中均達(dá)到了80%以上,說明在損傷中心灶注射的慢病毒載體主要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為損傷局部的炎癥細(xì)胞。4.通過ELISA對損傷節(jié)段處BDNF的總體表達(dá)水平檢測顯示lenti-BDNF組(62.63±8.74 ng/g)的表達(dá)水平明顯高于lenti-EGFP組(0.59±0.15 ng/g)以及saline組(0.68±0.13 ng/g)(P0.001)。結(jié)論1.Lenti-BDNF慢病毒包裝成功,病毒滴度較高,能夠滿足實驗需要。2.改良動脈夾夾傷模型能夠更好的保護(hù)硬脊膜完整,更適合損傷局部慢病毒注射。3.損傷中心處注射的慢病毒載體主要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為損傷局部的炎癥細(xì)胞。此種注射方法有利于對BDNF在免疫炎癥調(diào)節(jié)中的作用進(jìn)行研究。4.通過ELISA定量檢測證實,Lenti-BDNF載體在損傷節(jié)段成功過表達(dá)。第二部分SCI后損傷處過表達(dá)BDNF在免疫炎癥調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)中具有顯著作用第一節(jié):損傷中心處過表達(dá)BDNF可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型由M1向M2轉(zhuǎn)變并對炎癥微環(huán)境具有明顯的調(diào)節(jié)作用材料與方法1.實驗對象;成年雌性C57BL/6小鼠跟據(jù)注射載體的不同分為:Lenti-EGFP組,Lenti-BDNF組和Saline組(于損傷中心處注射生理鹽水)以及Sham組(僅進(jìn)行椎板切除,不對脊髓造成損傷)。2.通過免疫熒光對巨噬細(xì)胞表型進(jìn)行檢測;對各組損傷組織切片進(jìn)行CD16/32(M1標(biāo)記物)和Arginase-1(M2標(biāo)記物)免疫熒光標(biāo)記,檢測各組巨噬細(xì)胞表型的變化。3.通過流式細(xì)胞學(xué)進(jìn)行M1/M2表型檢測分析;對損傷節(jié)段進(jìn)行取材(損傷中心至頭側(cè)和尾側(cè)各1.5mm),消化,洗滌,過濾后獲得單細(xì)胞懸液,然后予以M1表型(CD16/32,i NOS,)和M2表型(arginase-1,CD206)流式抗體孵育及檢測。4.炎癥因子的表達(dá)水平檢測;對各組損傷節(jié)段促炎因子(TNF-a,IL-1β)和抑炎因子(IL-10,IL-13)的表達(dá)水平進(jìn)行ELISA檢測。5.在體外培養(yǎng)骨髓來源巨噬細(xì)胞(BMDM)過程中進(jìn)行BDNF刺激,并通過q RT-PCR檢測炎癥因子的表達(dá)水平以及通過Western Blot檢測arginase-1和i NOS的蛋白表達(dá)水平,以明確BDNF是否可以直接作用于對巨噬并對其表型產(chǎn)生影響。結(jié)果1.共聚焦結(jié)果顯示脊髓損傷后lenti-BDNF組arginase-1陽性細(xì)胞數(shù)相比lenti-EGFP組和saline組明顯增多(P0.05),而lenti-BDNF組CD16/32陽性細(xì)胞數(shù)比lenti-EGFP組和saline組明顯減少(P0.05)。此外,與Lenti-EGFP組相比Lenti-BDNF組中未與EGFP共定位的Arginase-1+細(xì)胞百分比明顯升高,同時未與EGFP共定位的CD16/32+細(xì)胞百分比顯著降低(P0.05)。2.流式結(jié)果分析顯示,與lenti-EGFP組和saline組相比,lenti-BDNF組中與M1表型相關(guān)的CD16/32和i NOS陽性細(xì)胞百分比明顯下降,而與M2表型相關(guān)的arginase-1和CD206陽性細(xì)胞百分比顯著上升。3.ELISA檢測結(jié)果顯示損傷局部過表達(dá)BDNF可以明顯降低促炎因子IL-1β和TNF-α的表達(dá),同時顯著上調(diào)抑炎因子IL-10和IL-13的表達(dá)。4.在體外試驗中,q RT-PCR檢測經(jīng)BDNF刺激的BMDM的炎癥因子的表達(dá)與對照組無明顯差異,Western Blot檢測表型相關(guān)蛋白arginase-1和i NOS的表達(dá)與對照組亦無顯著差異。結(jié)論1.SCI后損傷中心處過表達(dá)BDNF可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1向M2表型轉(zhuǎn)變,并且初步分析顯示,損傷處巨噬細(xì)胞極性的轉(zhuǎn)變可能并非通過BDNF直接作用于巨噬細(xì)胞引起的。2.過表達(dá)BDNF可以抑制促炎因子的表達(dá)并上調(diào)抑炎因子的表達(dá)水平,在改善炎癥微環(huán)境中具有一定的作用。3.體外重組BDNF刺激BMDM后,并未引起巨噬細(xì)胞表型的改變,表明重組BDNF不能直接作用于巨噬細(xì)胞。第二節(jié):損傷中心處過表達(dá)BDNF可以促進(jìn)SCI后的神經(jīng)損傷修復(fù)材料和方法1.運(yùn)動功能評估;通過曠場試驗對Lenti-EGFP和Lenti-BDNF兩組小鼠的行為學(xué)予以Basso Mouse Scale(BMS)評分,以評價BDNF對SCI后運(yùn)動功能恢復(fù)的影響。2.脫髓鞘檢測;通過對Lenti-EGFP和Lenti-BDNF組脊髓損傷節(jié)段矢狀位切片進(jìn)行Luxol Fast Blue(LFB)染色,以評估BDNF對髓鞘的保護(hù)作用。3.BDA(Biotinylated dextran amine)示蹤;脊髓損傷后14天向小鼠運(yùn)動皮層予以BDA注射,對損傷后的皮質(zhì)脊髓束(CST)進(jìn)行示蹤,觀察BDNF對CST軸突回縮的影響。4.對損傷局部神經(jīng)纖維的影響;通過對Lenti-EGFP和Lenti-BDNF損傷節(jié)段進(jìn)行NF-200免疫熒光染色,觀察BDNF對損傷局部神經(jīng)纖維的影響。結(jié)果1.通過對兩組小鼠損傷后1,3,7,14,28天進(jìn)行BMS評分顯示,亞急性期Lenti-BDNF組的小鼠運(yùn)動功能恢復(fù)較Lenti-EGFP組明顯提高。2.LFB染色結(jié)果顯示Lenti-BDNF組脫髓鞘程度較Lenti-EGFP組明顯減輕。3.結(jié)果顯示Lenti-BDNF組CST軸突末端距離損傷邊緣較Lenti-EGFP組明顯縮短,表明過表達(dá)BDNF可以顯著減少CST的軸突回縮。4.NF-200免疫熒光染色結(jié)果顯示損傷中心處過表達(dá)BDNF可以明顯抑制神經(jīng)纖維的崩解,具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)論SCI后損傷局部過表達(dá)BDNF能顯著促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù),具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。但需要注意的是:損傷中心處注射慢病毒載體以轉(zhuǎn)染損傷局部炎癥細(xì)胞為主,而并非損傷周圍的神經(jīng)元、軸突、少突膠質(zhì)細(xì)胞等。所以本研究中BDNF對免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用在神經(jīng)保護(hù)中可能起了重要的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R651.2

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本文編號：1470386