本文關鍵詞： 結核分枝桿菌DNA 脊柱結核 熒光定量PCR 快速診斷 16Sr DNA CFP10　出處：《南華大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的探討及推廣熒光定量PCR技術在脊柱結核診斷中的應用方法選擇結核分枝桿菌16Sr DNA和CFP10兩個基因作為本次實驗的靶基因,分別設計兩對特異性的引物,應用SYBR Green I法(熒光染料法)建立熒光定量PCR反應體系,依據(jù)基因數(shù)據(jù)庫中所提供的兩種基因的保守序列,利用人工化學合成法獲得目的基因,構建重組質(zhì)粒體p GH-16Sr DNA和p GH-CFP10,并對重組質(zhì)粒體進行酶切鑒定和序列測定,成功構建陽性標準品,并制作出標準曲線及曲線方程,最后用此方法對20例臨床確診為脊柱結核患者的血漿標本以及20例非脊柱結核患者的血漿標本進行檢測與定量。結果本次實驗中所建立的熒光定量方法線性關系好,均呈線性負相關。兩個基因(16Sr DNA和CFP10)的標準曲線的相關系數(shù)分別達到0.999和0.998,實驗中最低檢測下限分別達到1.48×101copies/ul和2.67×101copies/ul,而且特異性好,兩條基因的溶解曲線均呈現(xiàn)單一的峰值,沒有出現(xiàn)非特異性擴增產(chǎn)物以及引物二聚體的干擾。在臨床上已確診的20例脊柱結核患者的血漿MTB-DNA的檢測結果提示二者全部為陽性,20例非脊柱結核感染患者的血漿MTB-DNA檢測結果有19為陰性,1例提示為陽性,并且平均檢測一份臨床血漿標本的時間僅為2小時。結論本實驗成功建立了以16Sr DNA和CFP10為靶基因的脊柱結核熒光定量PCR檢測體系,可以初步用于臨床脊柱結核患者的結核分枝桿菌病原體檢測及定量。
[Abstract]:Objective to explore and extend the application of fluorescent quantitative PCR in the diagnosis of spinal tuberculosis. Methods Mycobacterium tuberculosis 16Sr DNA and CFP10 genes were selected as the target genes in this experiment. Two pairs of specific primers were designed, and the fluorescent quantitative PCR reaction system was established by SYBR Green I method (fluorescent dye method). According to the conserved sequences of the two genes in the gene database, the target genes were obtained by artificial chemical synthesis, and the recombinant plasmids, p GH-16Sr DNA and p GH-CFP10, were constructed. The recombinant plasmid was identified by restriction endonuclease digestion and sequenced. The positive standard product was successfully constructed and the standard curve and curve equation were made. Finally, the plasma samples of 20 patients with clinically diagnosed spinal tuberculosis and 20 patients with non-spinal tuberculosis were detected and quantified by this method. Results the fluorescence quantitative method established in this experiment was linear. It's good. The correlation coefficients of the standard curves of 16Sr DNA and CFP10 were 0.999 and 0.998, respectively. The lowest detection limits were 1.48 脳 10 ~ (-1) copi / ul and 2.67 脳 10 ~ ((1)) / r ~ (-1) respectively, and the specificity was good. The dissolution curve of the two genes showed a single peak. There was no interference of nonspecific amplification products and primer dimer. The detection results of plasma MTB-DNA in 20 patients with spinal tuberculosis confirmed clinically showed that both of them were positive. The results of plasma MTB-DNA in 20 patients with non-spinal tuberculosis infection were 19 negative and 1 positive. The average time for detecting a clinical plasma sample was only 2 hours. Conclusion A fluorescent quantitative PCR system for detecting spinal tuberculosis with 16Sr DNA and CFP10 as target genes has been successfully established in this experiment. It can be used for the detection and quantification of Mycobacterium tuberculosis pathogens in patients with spinal tuberculosis.
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R687.3

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本文編號：1467919