本文關(guān)鍵詞：過表達(dá)SDF-1α促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的體外研究　出處：《福建醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的研究表明,SDF-1/CXCR4軸不僅能夠促進(jìn)移植后的BMSCs向損傷組織遷移,而且具有抑制BMSCs凋亡、增加BMSCs的存活率及增強(qiáng)BMSCs增殖活性等作用,從多方面提高BMSCs向損傷組織的歸巢效率。因此我們設(shè)想通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源性SDF-1基因?qū)隑MSCs,提高SDF-1在BMSCs的表達(dá)率,從而增強(qiáng)BMSCs的遷移能力。方法1.構(gòu)建過表達(dá)SDF-1α重組慢病毒載體(p NL-SDF-1α-IRES2-EGFP),進(jìn)行PCR、雙酶切及測序鑒定;2.將已經(jīng)構(gòu)建好的慢病毒載體質(zhì)粒p NL-SDF-1α-IRES2-EGFP、p NL-IRES2-EGFP、GV-118-SDF-1α-si RNA與其輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝生產(chǎn)慢病毒,并進(jìn)行病毒濃縮和功能滴度測定;用相同滴度的過表達(dá)SDF-1α慢病毒、空載體慢病毒、SDF-1α基因沉默慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)BMSCs,建立穩(wěn)定過表達(dá)SDF-1α的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系;采用RT-PCR、Western Blot的方法檢測三組中SDF-1αm RNA和蛋白的表達(dá)水平;3.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測SDF-1α對BMSCs遷移的影響;抗SDF-1α多抗阻斷后觀察細(xì)胞遷移的變化。結(jié)果1、成功構(gòu)建SDF-1α重組慢病毒載體(p NL-SDF-1α-IRES2-EGFP質(zhì)粒)。2、慢病毒轉(zhuǎn)染48h后可在倒置熒光顯微鏡下觀察到大量293T細(xì)胞表達(dá)EGFP,EGFP陽性率可達(dá)95%以上,轉(zhuǎn)SDF-1α基因、空載體及SDF-1α基因沉默BMSCs強(qiáng)烈表達(dá)EGFP。RT-PCR、Western Blot證實(shí)SDF-1α-BMSCs組過表達(dá)SDF-1α,si RNA-BMSCs組SDF-1α表達(dá)明顯被抑制。3、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)提示SDF-1α可明顯促進(jìn)BMSCs的跨膜遷移。SDF-1α-BMSCs組及null-BMSCs組在抗SDF-1α多抗作用后遷移指數(shù)明顯下降,而si RNA-BMSCs組抗體阻斷后與阻斷前無明顯差異。結(jié)論利用成功構(gòu)建過表達(dá)SDF-1α基因及SDF-1α基因沉默慢病毒載體包裝生產(chǎn)慢病毒,進(jìn)而感染BMSCs,通過RT-PCR、Western Blot檢測SDF-1αm RNA、蛋白的表達(dá)水平,證實(shí)過表達(dá)SDF-1α能增強(qiáng)BMSCs中SDF-1α基因表達(dá),而SDF-1α基因沉默能抑制BMSCs中SDF-1α基因表達(dá),Transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明,過表達(dá)SDF-1α促進(jìn)BMSCs跨膜遷移,而SDF-1α基因沉默后這種遷移明顯被抑制。加入抗SDF-1α后,BMSCs跨膜遷移的細(xì)胞數(shù)明顯減少。
[Abstract]:Objective to demonstrate that the SDF-1 / CXCR4 axis can not only promote the migration of BMSCs to injured tissue, but also inhibit the apoptosis of BMSCs. The survival rate of BMSCs and the proliferative activity of BMSCs were increased. In order to improve the homing efficiency of BMSCs to damaged tissues in many ways, we envisage the introduction of exogenous SDF-1 gene into BMSCs by transgenic technology. The expression rate of SDF-1 in BMSCs was increased. Methods 1. Construction of recombinant lentivirus vector expressing SDF-1 偽 -IRES2-EGFPN for PCR. 2. Double enzyme digestion and sequencing; 2.Recombinant lentivirus vector p NL-SDF-1 偽 -IRES2-EGFPP NL-IRES2-EGFP was constructed. GV-118-SDF-1 偽 -si RNA was co-transfected into 293T cells with its coplasmid to produce lentivirus, and the virus concentration and function titer were determined. SDF-1 偽 lentivirus was over-expressed with the same titer, and the empty vector lentivirus SDF-1 偽 gene silenced lentivirus transduction BMSCs. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) with stable overexpression of SDF-1 偽 were established. The expression of SDF-1 偽 m RNA and protein in the three groups was detected by RT-PCR Blot. 3. The effect of SDF-1 偽 on BMSCs migration was detected by Transwell migration experiment. The changes of cell migration were observed after blocking SDF-1 偽 polyclonal antibody. Results 1. The recombinant lentivirus vector of SDF-1 偽 was successfully constructed. The plasmid of p NL-SDF-1 偽 -IRES2-EGFP was constructed. After 48 hours of lentivirus transfection, a large number of 293T cells were observed to express EGFP-EGFP-positive rate of more than 95% under inverted fluorescence microscope, and the expression rate of EGFP-a gene was higher than 95%. The empty vector and SDF-1 偽 gene silenced BMSCs strongly expressed EGFP.RT-PCR. Western Blot confirmed that the overexpression of SDF-1 偽 in SDF-1 偽 -BMSCs group was significantly inhibited in RNA-BMSCs group. Transwell migration experiment showed that SDF-1 偽 could significantly promote the transmembrane migration of BMSCs. SDF-1 偽 -BMSCs group and null-BMSCs group in anti-#en4# 偽. The migration index decreased significantly after the action of multiple reactives. And si... There was no significant difference between the antibody of RNA-BMSCs group and that before blocking. Conclusion Lentivirus can be produced by successfully constructing SDF-1 偽 gene and SDF-1 偽 gene silencing lentivirus vector. The expression level of SDF-1 偽 m RNAs and protein was detected by RT-PCRG Western Blot. It was proved that overexpression of SDF-1 偽 could enhance the expression of SDF-1 偽 gene in BMSCs, while SDF-1 偽 gene silencing could inhibit the expression of SDF-1 偽 gene in BMSCs. Transwell migration assay showed that overexpression of SDF-1 偽 promoted the transmembrane migration of BMSCs, while that of SDF-1 偽 gene was significantly inhibited after the silencing of SDF-1 偽 gene. The number of cells transmembrane migration of BMSCs was significantly decreased.
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R651.2

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本文編號：1441372