本文關鍵詞：神經肽Y對大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化調控效應及其經典Wnt信號通路相關性研究

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【摘要】：骨折及骨不愈合、延遲愈合等是創(chuàng)傷骨科常見疾病,其治療的方法和相關原理一直是骨科領域內研究的難點和熱點問題,如果臨床療效效果不佳則會對患者的預后帶來嚴重的影響。因此為了改善患者的功能預后,探討骨代謝、骨再生等的生物學機制及其病理生理學特點是基礎和前提。對骨折再生和重建過程中多種因素的生物學效應及調控機制進行廣泛深入的研究,也將為臨床治療提供了全新治療思路和技術方法。骨骼感覺神經元能分泌多種神經肽,包括降鈣素基因多肽(Calcitonin gene related pept ide, CGRP)、神經肽Y (Neuropeptide Y, NPY)和P物質(substance P,SP)等。以往研究表明,神經肽可通過多種途徑影響骨組織形成及代謝,對骨折愈合過程也著有非常重要的作用。在哺乳動物中樞神經系統(tǒng)中分布廣泛、含量最高的神經肽之一就是神經肽Y。NPY是一個由三十幾種氨基酸脫水縮合而成的化合物,具有多樣生理功能,其中NPY經典的生理作用主要是調節(jié)心血管活動以及調控攝食行為等。神經肽Y受體屬于G蛋白耦聯(lián)超受體家族,主要有Y1、Y2、Y4、Y5和Y6五個亞型,其中Y1和Y2受體與調控骨代謝緊密相關。在骨內,神經肽Y主要是經過Y1受體來發(fā)揮其效應；而在中樞神經系統(tǒng)中神經肽Y通過下丘腦上的Y2受體對骨代謝調控發(fā)揮作用。迄今已有不少體內和體外細胞學實驗證實,神經肽Y及其受體對調控骨再生、重塑、形成機制作用重要,但神經肽Y對骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的生物學效應仍存爭議且作用機制不明確。因此,進一步研究明確神經肽Y對骨髓間充質干細胞的成骨分化效應有助于了解神經肽在骨代謝過程中的作用。骨折愈合過程中是多種組織、因子之間錯綜復雜的協(xié)同效應,骨折端多種促進骨折愈合的蛋白以及血管的新生對骨折愈合起著十分重要的作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是其中一種重要的蛋白,能夠在骨折愈合過程中促進骨再生和骨重建。在骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)促進成骨效應最為明顯。而血管新生是成骨發(fā)生的先決條件,血管的生成不僅能恢復骨折斷端的血流,為骨的發(fā)育供給營養(yǎng)成分,還能通過生長因子調控成骨細胞活性以促進成骨。血液供應的重建在骨生理中的作用也已被眾多研究探討并證實了其重要性。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)作為最強的促血管生成因子,對骨折愈合過程中血管的新生與周圍組織血供的維持起著重要的作用。因此,探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白2以及血管內皮生長因子的表達與神經肽Y調控骨髓間充質干細胞成骨分化的相關性可能是NPY調控骨折愈合生理過程的重要環(huán)節(jié)。細胞生物學效應與細胞信號通路的關系密不可分。經典Wnt/β-catenin信號通路是骨代謝生理的關鍵通路因素,已有實驗證實Wnt/β-catenin信號通路在骨生理和骨形成等過程中起重要作用,激活Wnt/β-catenin信號通路可以促進骨形成并增加骨量。經典Wnt信號通路可以概括為β-鏈蛋白(p-catenin)在細胞質內積聚,積累到一定程度時P-catenin轉移進入細胞核內引起下游Wnt相關靶基因轉錄表達。目前經典Wnt/β-catenin信號通路對于神經肽Y作用后骨髓間充質干細胞成骨分化的作用以及其與BMP-2、VEGF等相關因子的協(xié)同作用等方面仍未見相關文獻報道。因此NPY作用于BMSCs的生物學效應是否由經典Wnt信號通路介導有必要進行研究�；谝陨媳尘�,本研究以骨髓間充質干細胞為研究對象,探討神經肽Y對其成骨分化以及BMP-2、VEGF等相關因子表達的影響,并從經典Wnt/β-catenin信號轉導通路角度探討其相關機制。本次研究將進一步加深目前對神經因素通過神經肽調控骨折愈合的分子機制的認識,以及為其在骨折以及骨代謝疾病中的臨床應用提供新的思路和實驗依據(jù)。本實驗主要的實驗材料、方法、內容和結論主要包括以下幾個部分：總體研究目的1.神經肽Y對大鼠BMSCs成骨分化的影響；2.神經肽Y在大鼠BMSCs成骨分化過程中BMP-2、VEGF表達的影響；3.神經肽Y調控大鼠BMSCs生物學效應與其相關Wnt通路的初步探討。第1部分 神經肽Y對大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化的影響研究目的：通過全骨髓貼壁法獲取SD大鼠骨髓間充質干細胞,采用流式鑒定法鑒定其純度,同時探討不同濃度神經肽Y對BMSCs成骨分化的影響。實驗方法：1. BMSCs細胞獲取、培養(yǎng)及鑒定選取實驗動物80-100g左右的SD大鼠(雌雄不限),按照實驗動物倫理學要求采用頸椎脫臼法處死大鼠,于清潔條件無菌器械輔助下,逐層切開大鼠解剖結構后獲取大鼠雙側的股骨及脛骨。使用注射器針頭沖洗骨髓腔直至骨髓腔兩端泛白,加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(低糖)行全骨髓法分離培養(yǎng)BMSCs。培養(yǎng)兩到三天后,換液去除未貼壁的血細胞等,按照1：2的接種比例經胰酶消化后傳代至25 cm2培養(yǎng)瓶中,采用含體積分數(shù)10%胎牛血清及體積分數(shù)1%青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)基每2-3天換液1次,大約7天左右細胞生長鋪滿瓶底后可傳三代,胰酶消化后按1：2傳代,通過光鏡及倒置顯微鏡觀察SD大鼠BMSCs生長及形態(tài)變化特點。取三代BMSCs不含EDTA胰酶消化,PBS沖洗細胞3次計數(shù),采用流式鑒定法檢測表面標記CD29、CD34、CD44、CD45表達情況。2.實驗分組處理將細胞分為四組,對照組(加入等量PBS), NPY(10-8mol/L)組,NPY(10-10 mol/L)組,NPY (10-12mol/L)組,將3代的BMSCs更換成骨誘導培養(yǎng)液(10mM β-甘油磷酸鈉,100 nM地塞米松,5Oμg/mL維生素C,10% FBS, a-MEM)進行成骨誘導培養(yǎng),于培養(yǎng)7、14天對細胞進行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和茜素紅染色；培養(yǎng)7、14、21天采用q-PCR法檢測各組成骨標志物ALP,Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ),骨鈣素(osteocalcin)及Runx2的基因表達情況,Western blot法檢測ALP蛋白表達情況,以確定在成骨誘導環(huán)境下NPY對BMSCs成骨分化調控效應的濃度特異性。3.堿性磷酸酶染色和茜素紅染色檢測細胞成骨染色取第三代BMSCs,更換成骨誘導培養(yǎng)液,于成骨誘導第7天對細胞進行ALP染色,PBS清洗三遍后在96孔板內加入甲醇固定,隨后加入ALP染液,沖洗封片。于培養(yǎng)14天對細胞進行茜素紅染色,PBS沖洗后經24孔板內加入95%酒精固定細胞,然后茜素紅染色5min;蒸餾水沖洗若干次,干燥,封片。最后放置顯微鏡下觀察成骨誘導效果并拍照。4. q-PCR、Western blot檢測成骨基因和蛋白表達提取實驗組總RNA后進行逆轉錄反應,熒光定量測定ALP, collagen type Ⅰ, osteocalcin及Runx2含量。相關結果于7天、14天和21天分別測定三次。提取實驗組ALP蛋白后,定量測定ALP蛋白表達。實驗結果：在體外可通過全骨髓貼壁法成功分離培養(yǎng)出可用于實驗的較高純度大鼠BMSCs。經流式細胞術鑒定結果顯示CD29 (92.4%±1.6%), CD34 (5.1%±1.3%), CD44 (86.7%±3.1%),, CD45(9.2%±2.5%),符合骨髓間充質干細胞的免疫表型特征。不同濃度NPY作用于BMSCs可不同程度提高成骨標志物以及ALP蛋白水平表達,其中以NPY (10-10mol/L)濃度調控成骨效應最為強烈。實驗結論：神經肽Y可以促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化。第2部分 神經肽Y在大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化過程中對骨形成蛋白2和血管內皮生長因子表達的影響研究目的：探討不同濃度NPY在BMSCs成骨分化中對BMP-2和VEGF表達的影響。實驗方法：1.實驗分組處理將細胞分為四組,對照組(加入等量PBS),NPY(10-8mol/L)組,NPY(10-10 mol/L)組,NPY (10-12mol/L)組,將3代的BMSCs更換成骨誘導液(10mMβ-甘油磷酸鈉,100 nM地塞米松,50μg/mL維生素C,10% FBS, a-MEM)進行成骨誘導培養(yǎng),于培養(yǎng)7、14、21天對細胞進行DAB免疫組化染色,采用q-PCR和Western blot法檢測BMP、VEGF基因和蛋白的表達情況。2.免疫組織化學法測定BMP-2和VEGF表達取三代細胞進行實驗處理后,甲醇固定液固定半小時后,使用體積分數(shù)為0.1%Triton X破膜10分鐘。封閉內源性過氧化物酶。脫脂牛奶室溫封閉10min。加入VEGF、BMP2一抗孵育,4-C避光孵育過夜,二抗室溫下孵育30mmin,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)對細胞質進行顯色。干燥,封片。最后放置顯微鏡下觀察成骨誘導效果并拍照。3. q-PCR和Western blot法檢測BMP-2、VEGF基因和蛋白的表達取三代細胞進行實驗處理后,提取實驗組總RNA后進行逆轉錄反應,熒光定量測定BMP-2、VEGF含量。相關結果于7天、14天和21天分別測定三次。提取實驗組BMP-2、VEGF蛋白后,定量測定BMP-2、VEGF蛋白表達。實驗結果：免疫組織化學結果顯示在神經肽NPY作用后的第7、14、21天,BMP-2和VEGF的DAB染色陽性,細胞質呈棕黃色。q-PCR和Western blot結果示NPY作用于BMSCs后7、14、21天,可提高BMP-2、VEGF基因和蛋白的表達。實驗結論：在骨髓間充質干細胞成骨分化過程中,神經肽Y可以促進細胞表達BMP-2和VEGF,且效應具有濃度特異性。第3部分神經肽Y調控BMSCs生物學效應及其相關Wnt通路的初步探討研究目的：初步探討NPY調控BMSCs生物學效應及其與經典Wnt通路相關性。實驗方法：1.實驗分組處理根據(jù)上述實驗所確定的NPY濃度,取三代BMSCs,將細胞分為四組,對照組(加入等量PBS), NPY (10-10mol/L)組,NPY (10-10mol/L)+NPYY1受體拮抗劑組PD160170 (1μM)組以及NPY (10-10mol/L)+Wnt通路拮抗劑DKK1(0.2μg/mL)組。q-PCR測定成骨標志物ALP, collagen type Ⅰ, osteocalcin、Runx2、BMP-2和VEGF基因以及Wnt信號通路相關基因β-Catenin基因的表達,Western blot法檢測Wnt信號通路相關蛋白β-Catenin和p-GSK-3β蛋白的表達。2. q-PCR、Western blot法檢測Wnt通路和成骨標志物基因、蛋白表達提取實驗組總RNA后進行逆轉錄反應,熒光定量測定ALP, collagen type Ⅰ, osteocalcin、Runx2和β-Catenin含量。相關結果于培養(yǎng)7、14、21天分別測定三次。提取實驗組β-Catenin和P-GSK-3β蛋白后,定量測定β-Catenin和P-GSK-3β蛋白表達。3.免疫細胞熒光法檢測β-catenin蛋白定位取三代BMSCs進行實驗處理后,甲醇固定液處理30分鐘后,使用體積分數(shù)0.1%Triton X破膜10分鐘,脫脂牛奶封閉抗體30分鐘,隨后用以1：300稀釋的β-catenin一抗PBST溶液在4。避光條件下孵育過夜。PBS沖洗三次后,加入FITC綠色熒光二抗在室溫下避光孵育30分鐘,吸出液體后使用DAPI染色15分鐘,放置熒光顯微鏡下觀察并拍照。實驗結果：10-10mol/L濃度的NPY能明顯提高BMSCs細胞成骨標志物、Wnt/β-catenin信號轉導通路相關基因的表達,同時能提高β-catenin蛋白和β-GSK-3β蛋白的表達,并可促進β-catenin蛋白轉移進入細胞核,NPYY1受體拮抗劑、Wnt信號通路抑制劑DKK1能明顯抑制NPY的這些作用。實驗結論：神經肽Y調控骨髓間充質干細胞的生物學效應調控機制可能與經典Wnt信號轉導通路的激活有關。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R683

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