神經(jīng)肽Y對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化調(diào)控效應(yīng)及其經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相關(guān)性研究
本文關(guān)鍵詞:神經(jīng)肽Y對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化調(diào)控效應(yīng)及其經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相關(guān)性研究
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【摘要】:骨折及骨不愈合、延遲愈合等是創(chuàng)傷骨科常見(jiàn)疾病,其治療的方法和相關(guān)原理一直是骨科領(lǐng)域內(nèi)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問(wèn)題,如果臨床療效效果不佳則會(huì)對(duì)患者的預(yù)后帶來(lái)嚴(yán)重的影響。因此為了改善患者的功能預(yù)后,探討骨代謝、骨再生等的生物學(xué)機(jī)制及其病理生理學(xué)特點(diǎn)是基礎(chǔ)和前提。對(duì)骨折再生和重建過(guò)程中多種因素的生物學(xué)效應(yīng)及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行廣泛深入的研究,也將為臨床治療提供了全新治療思路和技術(shù)方法。骨骼感覺(jué)神經(jīng)元能分泌多種神經(jīng)肽,包括降鈣素基因多肽(Calcitonin gene related pept ide, CGRP)、神經(jīng)肽Y (Neuropeptide Y, NPY)和P物質(zhì)(substance P,SP)等。以往研究表明,神經(jīng)肽可通過(guò)多種途徑影響骨組織形成及代謝,對(duì)骨折愈合過(guò)程也著有非常重要的作用。在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛、含量最高的神經(jīng)肽之一就是神經(jīng)肽Y。NPY是一個(gè)由三十幾種氨基酸脫水縮合而成的化合物,具有多樣生理功能,其中NPY經(jīng)典的生理作用主要是調(diào)節(jié)心血管活動(dòng)以及調(diào)控?cái)z食行為等。神經(jīng)肽Y受體屬于G蛋白耦聯(lián)超受體家族,主要有Y1、Y2、Y4、Y5和Y6五個(gè)亞型,其中Y1和Y2受體與調(diào)控骨代謝緊密相關(guān)。在骨內(nèi),神經(jīng)肽Y主要是經(jīng)過(guò)Y1受體來(lái)發(fā)揮其效應(yīng);而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)肽Y通過(guò)下丘腦上的Y2受體對(duì)骨代謝調(diào)控發(fā)揮作用。迄今已有不少體內(nèi)和體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí),神經(jīng)肽Y及其受體對(duì)調(diào)控骨再生、重塑、形成機(jī)制作用重要,但神經(jīng)肽Y對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的生物學(xué)效應(yīng)仍存爭(zhēng)議且作用機(jī)制不明確。因此,進(jìn)一步研究明確神經(jīng)肽Y對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化效應(yīng)有助于了解神經(jīng)肽在骨代謝過(guò)程中的作用。骨折愈合過(guò)程中是多種組織、因子之間錯(cuò)綜復(fù)雜的協(xié)同效應(yīng),骨折端多種促進(jìn)骨折愈合的蛋白以及血管的新生對(duì)骨折愈合起著十分重要的作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是其中一種重要的蛋白,能夠在骨折愈合過(guò)程中促進(jìn)骨再生和骨重建。在骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)促進(jìn)成骨效應(yīng)最為明顯。而血管新生是成骨發(fā)生的先決條件,血管的生成不僅能恢復(fù)骨折斷端的血流,為骨的發(fā)育供給營(yíng)養(yǎng)成分,還能通過(guò)生長(zhǎng)因子調(diào)控成骨細(xì)胞活性以促進(jìn)成骨。血液供應(yīng)的重建在骨生理中的作用也已被眾多研究探討并證實(shí)了其重要性。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)作為最強(qiáng)的促血管生成因子,對(duì)骨折愈合過(guò)程中血管的新生與周?chē)M織血供的維持起著重要的作用。因此,探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白2以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)與神經(jīng)肽Y調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的相關(guān)性可能是NPY調(diào)控骨折愈合生理過(guò)程的重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)與細(xì)胞信號(hào)通路的關(guān)系密不可分。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路是骨代謝生理的關(guān)鍵通路因素,已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨生理和骨形成等過(guò)程中起重要作用,激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以促進(jìn)骨形成并增加骨量。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路可以概括為β-鏈蛋白(p-catenin)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積聚,積累到一定程度時(shí)P-catenin轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)引起下游Wnt相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。目前經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)于神經(jīng)肽Y作用后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用以及其與BMP-2、VEGF等相關(guān)因子的協(xié)同作用等方面仍未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此NPY作用于BMSCs的生物學(xué)效應(yīng)是否由經(jīng)典Wnt信號(hào)通路介導(dǎo)有必要進(jìn)行研究;谝陨媳尘,本研究以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對(duì)象,探討神經(jīng)肽Y對(duì)其成骨分化以及BMP-2、VEGF等相關(guān)因子表達(dá)的影響,并從經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路角度探討其相關(guān)機(jī)制。本次研究將進(jìn)一步加深目前對(duì)神經(jīng)因素通過(guò)神經(jīng)肽調(diào)控骨折愈合的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí),以及為其在骨折以及骨代謝疾病中的臨床應(yīng)用提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)主要的實(shí)驗(yàn)材料、方法、內(nèi)容和結(jié)論主要包括以下幾個(gè)部分:總體研究目的1.神經(jīng)肽Y對(duì)大鼠BMSCs成骨分化的影響;2.神經(jīng)肽Y在大鼠BMSCs成骨分化過(guò)程中BMP-2、VEGF表達(dá)的影響;3.神經(jīng)肽Y調(diào)控大鼠BMSCs生物學(xué)效應(yīng)與其相關(guān)Wnt通路的初步探討。第1部分 神經(jīng)肽Y對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響研究目的:通過(guò)全骨髓貼壁法獲取SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,采用流式鑒定法鑒定其純度,同時(shí)探討不同濃度神經(jīng)肽Y對(duì)BMSCs成骨分化的影響。實(shí)驗(yàn)方法:1. BMSCs細(xì)胞獲取、培養(yǎng)及鑒定選取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物80-100g左右的SD大鼠(雌雄不限),按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求采用頸椎脫臼法處死大鼠,于清潔條件無(wú)菌器械輔助下,逐層切開(kāi)大鼠解剖結(jié)構(gòu)后獲取大鼠雙側(cè)的股骨及脛骨。使用注射器針頭沖洗骨髓腔直至骨髓腔兩端泛白,加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(低糖)行全骨髓法分離培養(yǎng)BMSCs。培養(yǎng)兩到三天后,換液去除未貼壁的血細(xì)胞等,按照1:2的接種比例經(jīng)胰酶消化后傳代至25 cm2培養(yǎng)瓶中,采用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清及體積分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基每2-3天換液1次,大約7天左右細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿(mǎn)瓶底后可傳三代,胰酶消化后按1:2傳代,通過(guò)光鏡及倒置顯微鏡觀察SD大鼠BMSCs生長(zhǎng)及形態(tài)變化特點(diǎn)。取三代BMSCs不含EDTA胰酶消化,PBS沖洗細(xì)胞3次計(jì)數(shù),采用流式鑒定法檢測(cè)表面標(biāo)記CD29、CD34、CD44、CD45表達(dá)情況。2.實(shí)驗(yàn)分組處理將細(xì)胞分為四組,對(duì)照組(加入等量PBS), NPY(10-8mol/L)組,NPY(10-10 mol/L)組,NPY (10-12mol/L)組,將3代的BMSCs更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(10mM β-甘油磷酸鈉,100 nM地塞米松,5Oμg/mL維生素C,10% FBS, a-MEM)進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng),于培養(yǎng)7、14天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和茜素紅染色;培養(yǎng)7、14、21天采用q-PCR法檢測(cè)各組成骨標(biāo)志物ALP,Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ),骨鈣素(osteocalcin)及Runx2的基因表達(dá)情況,Western blot法檢測(cè)ALP蛋白表達(dá)情況,以確定在成骨誘導(dǎo)環(huán)境下NPY對(duì)BMSCs成骨分化調(diào)控效應(yīng)的濃度特異性。3.堿性磷酸酶染色和茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞成骨染色取第三代BMSCs,更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液,于成骨誘導(dǎo)第7天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行ALP染色,PBS清洗三遍后在96孔板內(nèi)加入甲醇固定,隨后加入ALP染液,沖洗封片。于培養(yǎng)14天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色,PBS沖洗后經(jīng)24孔板內(nèi)加入95%酒精固定細(xì)胞,然后茜素紅染色5min;蒸餾水沖洗若干次,干燥,封片。最后放置顯微鏡下觀察成骨誘導(dǎo)效果并拍照。4. q-PCR、Western blot檢測(cè)成骨基因和蛋白表達(dá)提取實(shí)驗(yàn)組總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),熒光定量測(cè)定ALP, collagen type Ⅰ, osteocalcin及Runx2含量。相關(guān)結(jié)果于7天、14天和21天分別測(cè)定三次。提取實(shí)驗(yàn)組ALP蛋白后,定量測(cè)定ALP蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:在體外可通過(guò)全骨髓貼壁法成功分離培養(yǎng)出可用于實(shí)驗(yàn)的較高純度大鼠BMSCs。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果顯示CD29 (92.4%±1.6%), CD34 (5.1%±1.3%), CD44 (86.7%±3.1%),, CD45(9.2%±2.5%),符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型特征。不同濃度NPY作用于BMSCs可不同程度提高成骨標(biāo)志物以及ALP蛋白水平表達(dá),其中以NPY (10-10mol/L)濃度調(diào)控成骨效應(yīng)最為強(qiáng)烈。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:神經(jīng)肽Y可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。第2部分 神經(jīng)肽Y在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中對(duì)骨形成蛋白2和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響研究目的:探討不同濃度NPY在BMSCs成骨分化中對(duì)BMP-2和VEGF表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)方法:1.實(shí)驗(yàn)分組處理將細(xì)胞分為四組,對(duì)照組(加入等量PBS),NPY(10-8mol/L)組,NPY(10-10 mol/L)組,NPY (10-12mol/L)組,將3代的BMSCs更換成骨誘導(dǎo)液(10mMβ-甘油磷酸鈉,100 nM地塞米松,50μg/mL維生素C,10% FBS, a-MEM)進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng),于培養(yǎng)7、14、21天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DAB免疫組化染色,采用q-PCR和Western blot法檢測(cè)BMP、VEGF基因和蛋白的表達(dá)情況。2.免疫組織化學(xué)法測(cè)定BMP-2和VEGF表達(dá)取三代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理后,甲醇固定液固定半小時(shí)后,使用體積分?jǐn)?shù)為0.1%Triton X破膜10分鐘。封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。脫脂牛奶室溫封閉10min。加入VEGF、BMP2一抗孵育,4-C避光孵育過(guò)夜,二抗室溫下孵育30mmin,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)對(duì)細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行顯色。干燥,封片。最后放置顯微鏡下觀察成骨誘導(dǎo)效果并拍照。3. q-PCR和Western blot法檢測(cè)BMP-2、VEGF基因和蛋白的表達(dá)取三代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理后,提取實(shí)驗(yàn)組總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),熒光定量測(cè)定BMP-2、VEGF含量。相關(guān)結(jié)果于7天、14天和21天分別測(cè)定三次。提取實(shí)驗(yàn)組BMP-2、VEGF蛋白后,定量測(cè)定BMP-2、VEGF蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示在神經(jīng)肽NPY作用后的第7、14、21天,BMP-2和VEGF的DAB染色陽(yáng)性,細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色。q-PCR和Western blot結(jié)果示NPY作用于BMSCs后7、14、21天,可提高BMP-2、VEGF基因和蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中,神經(jīng)肽Y可以促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)BMP-2和VEGF,且效應(yīng)具有濃度特異性。第3部分神經(jīng)肽Y調(diào)控BMSCs生物學(xué)效應(yīng)及其相關(guān)Wnt通路的初步探討研究目的:初步探討NPY調(diào)控BMSCs生物學(xué)效應(yīng)及其與經(jīng)典Wnt通路相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)方法:1.實(shí)驗(yàn)分組處理根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)所確定的NPY濃度,取三代BMSCs,將細(xì)胞分為四組,對(duì)照組(加入等量PBS), NPY (10-10mol/L)組,NPY (10-10mol/L)+NPYY1受體拮抗劑組PD160170 (1μM)組以及NPY (10-10mol/L)+Wnt通路拮抗劑DKK1(0.2μg/mL)組。q-PCR測(cè)定成骨標(biāo)志物ALP, collagen type Ⅰ, osteocalcin、Runx2、BMP-2和VEGF基因以及Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因β-Catenin基因的表達(dá),Western blot法檢測(cè)Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-Catenin和p-GSK-3β蛋白的表達(dá)。2. q-PCR、Western blot法檢測(cè)Wnt通路和成骨標(biāo)志物基因、蛋白表達(dá)提取實(shí)驗(yàn)組總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),熒光定量測(cè)定ALP, collagen type Ⅰ, osteocalcin、Runx2和β-Catenin含量。相關(guān)結(jié)果于培養(yǎng)7、14、21天分別測(cè)定三次。提取實(shí)驗(yàn)組β-Catenin和P-GSK-3β蛋白后,定量測(cè)定β-Catenin和P-GSK-3β蛋白表達(dá)。3.免疫細(xì)胞熒光法檢測(cè)β-catenin蛋白定位取三代BMSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理后,甲醇固定液處理30分鐘后,使用體積分?jǐn)?shù)0.1%Triton X破膜10分鐘,脫脂牛奶封閉抗體30分鐘,隨后用以1:300稀釋的β-catenin一抗PBST溶液在4。避光條件下孵育過(guò)夜。PBS沖洗三次后,加入FITC綠色熒光二抗在室溫下避光孵育30分鐘,吸出液體后使用DAPI染色15分鐘,放置熒光顯微鏡下觀察并拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:10-10mol/L濃度的NPY能明顯提高BMSCs細(xì)胞成骨標(biāo)志物、Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因的表達(dá),同時(shí)能提高β-catenin蛋白和β-GSK-3β蛋白的表達(dá),并可促進(jìn)β-catenin蛋白轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核,NPYY1受體拮抗劑、Wnt信號(hào)通路抑制劑DKK1能明顯抑制NPY的這些作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:神經(jīng)肽Y調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)調(diào)控機(jī)制可能與經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】:南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2016
【分類(lèi)號(hào)】:R683
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10 姚遠(yuǎn);雷治海;蘇娟;楊桂紅;;神經(jīng)肽S對(duì)豬免疫調(diào)節(jié)的研究[A];中國(guó)解剖學(xué)會(huì)2011年年會(huì)論文文摘匯編[C];2011年
中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前9條
1 袁建秋;癲癇疾病通過(guò)神經(jīng)肽修復(fù)可獲新生[N];科技日?qǐng)?bào);2013年
2 編譯 王金元;神奇生物開(kāi)關(guān)控制人體胖瘦[N];北京科技報(bào);2007年
3 ;紅亮瘦素源[N];中國(guó)畜牧報(bào);2004年
4 張?zhí)锟?找出恐懼的生物根源[N];大眾科技報(bào);2009年
5 張超群 范曉莉;神經(jīng)肽P物質(zhì)可輔助移植肌蒂生長(zhǎng)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年
6 胥曉琦;兩位科學(xué)家的跨世紀(jì)之爭(zhēng)[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2003年
7 記者 任海軍;一種特殊基因變異可能導(dǎo)致早期冠心病[N];新華每日電訊;2009年
8 陳立希;“壓力激素”分泌越少,越能抗壓“無(wú)畏”[N];新華每日電訊;2009年
9 曾凡新 董志 傅潔民;新靶點(diǎn)研究促進(jìn)減肥新藥開(kāi)發(fā)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年
中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條
1 段開(kāi)鵬;胰島素通過(guò)下丘腦IKKβ/NF-κB-P0MC神經(jīng)肽通路調(diào)節(jié)膿毒癥機(jī)體高分解代謝的研究[D];南京大學(xué);2015年
2 廖原;人神經(jīng)肽S受體結(jié)構(gòu)功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2016年
3 鄧曉燕;家蠶神經(jīng)肽受體NPFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和內(nèi)吞分子機(jī)制的研究[D];浙江大學(xué);2012年
4 韓仁文;神經(jīng)肽S對(duì)記憶、結(jié)腸運(yùn)動(dòng)和攝食的調(diào)節(jié)作用[D];蘭州大學(xué);2009年
5 甘玲;家蠶腦組織基因表達(dá)譜和神經(jīng)肽及肽樣基因的功能研究[D];西南大學(xué);2011年
6 邵玉峰;神經(jīng)肽S對(duì)小鼠嗅覺(jué)的調(diào)控[D];蘭州大學(xué);2014年
7 趙正卿;神經(jīng)肽S在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)及其對(duì)睡眠/覺(jué)醒和認(rèn)知功能影響的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年
8 鮑嵐;神經(jīng)肽Y的Y_1受體在心臟和血管中的定位及在模擬失重大鼠腦動(dòng)脈中的分布[D];第四軍醫(yī)大學(xué);1999年
中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條
1 王明明;中樞微量注射神經(jīng)肽W對(duì)下丘腦室旁核區(qū)氨基酸含量的影響[D];延邊大學(xué);2015年
2 李婧;神經(jīng)肽S通過(guò)其受體抗alarm pheromones引起的小鼠焦慮樣行為[D];蘭州大學(xué);2014年
3 董朝玉;神經(jīng)肽S改善過(guò)敏性鼻炎引起的焦慮樣行為[D];蘭州大學(xué);2014年
4 藺洋春;多腸目渦蟲(chóng)神經(jīng)肽Myomodulin和FMRFamide的免疫組化定位及對(duì)肌細(xì)胞電位活動(dòng)影響的研究[D];魯東大學(xué);2016年
5 何豐;基于J2EE的神經(jīng)肽數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)[D];華中科技大學(xué);2014年
6 皮迪;基于PubMed摘要的神經(jīng)肽信息提取系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)[D];華中科技大學(xué);2014年
7 劉松;神經(jīng)肽Y對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化調(diào)控效應(yīng)及其經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相關(guān)性研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年
8 唐強(qiáng);神經(jīng)肽數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建及其前體預(yù)測(cè)[D];電子科技大學(xué);2016年
9 王正虹;神經(jīng)肽Y在營(yíng)養(yǎng)性肥胖小鼠下丘腦—垂體—卵巢軸中的表達(dá)特點(diǎn)[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2009年
10 陶麗;東方靜默類(lèi)放松運(yùn)動(dòng)對(duì)人血漿神經(jīng)肽Y影響研究[D];廣西民族大學(xué);2012年
,本文編號(hào):1304451
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