本文關(guān)鍵詞：血紅素氧合酶-1-血管內(nèi)皮祖細(xì)胞途徑在血紅素結(jié)合蛋白改善大鼠局灶性腦缺血再灌注后認(rèn)知障礙中的作用

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【摘要】：目的:缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷是缺血性腦卒中的重要發(fā)病基礎(chǔ),可以破壞血管內(nèi)皮和引起血管內(nèi)皮功能障礙。血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)可分化成熟為血管內(nèi)皮,參與受損血管的修復(fù)和血管再生。血紅素結(jié)合蛋白(hemopexin,HPX)可以特異性的結(jié)合并清除多余的游離血紅素,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,而血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是該過(guò)程的限速酶。利用大鼠局灶性缺血再灌注損傷模型,我們的前期研究發(fā)現(xiàn),HPX可以減輕大鼠缺血再灌注后的腦梗死面積,但是其具體機(jī)制并不甚清楚。本實(shí)驗(yàn)研究擬探討HO-1-EPCs途徑在HPX改善大鼠局灶性缺血再灌注后認(rèn)知功能障礙中的作用。方法:將雄性SD(Sprague Dawley,SD)大鼠,7-8周齡,體重250-280g,隨機(jī)(隨機(jī)數(shù)字表法)分為5組(n=20):假手術(shù)(Sham)組、局灶性缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion,MCAO)組、溶劑對(duì)照(MCAO+Vehicle)組、HPX治療(MCAO+HPX)組以及HO-1抑制劑鋅原卟啉Ⅸ(MCAO+HPX+ZnppIX)組。采用大腦中動(dòng)脈栓塞方法,制作大鼠局灶性缺血再灌注模型,生理鹽水、溶劑(Vehicle)疊氮鈉、HPX以及HO-1特異性抑制劑(zinc protoporphyrin IX,ZnppIX)均于缺血再灌注后即刻經(jīng)側(cè)腦室注射(intracerebroventricular injection,i.v.)方式給予。HPX給予劑量為10μl(1.86μg/μl),MCAO組大鼠側(cè)腦室注射10μl生理鹽水(0.9%NaCl),MCAO+Vehicle組大鼠側(cè)腦室注射10μl疊氮鈉(0.1%NaN3),MCAO+HPX+ZnppIX組大鼠側(cè)腦室給予10μl HPX和HO-1特異性抑制劑(zinc protoporphyrin IX,ZnppIX)的混合液(HPX1.86μg/μl+0.1%NaN3)。第一部分:側(cè)腦室注射HPX對(duì)大鼠局灶性缺血再灌注后行為學(xué)的影響。實(shí)驗(yàn)分為Sham組、MCAO組、MCAO+Vehicle組、MCAO+HPX組和MCAO+HPX+ZnppIX組,造模方法如上,造模前以及缺血再灌注后12h、24h、3d、5d、7d分別采用改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分(modified neurological severity scores,mNSS)評(píng)價(jià)各組大鼠神經(jīng)功能損傷程度;采用Morris水迷宮(morris water maze,mwm)視頻采集系統(tǒng)檢測(cè)各組大鼠缺血再灌注后2-7d的逃避潛伏期以及缺血再灌注后第7d時(shí)在目標(biāo)象限的時(shí)間百分比及穿過(guò)站臺(tái)次數(shù)。第二部分:ho-1-epcs途徑在hpx改善大鼠局灶性i/r后認(rèn)知障礙中的作用。首先,將實(shí)驗(yàn)分為sham組、mcao組、mcao+vehicle組、mcao+hpx組,造模方法同第一部分。i/r后2h、6h、12h、24h和7d取各組大鼠缺血半暗帶區(qū)腦組織,采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-timepolymerasechainreaction,rt-pcr)法檢測(cè)缺血半暗帶區(qū)腦組織中ho-1mrna的水平變化;利用蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)(westernblot)檢測(cè)大鼠缺血半暗帶區(qū)腦組織中ho-1蛋白質(zhì)的表達(dá);然后將大鼠隨機(jī)分為sham組、mcao組、mcao+vehicle組、mcao+hpx組以及mcao+hpx+znppix組,造模方法同第一部分,使用毛細(xì)采血管取各組大鼠內(nèi)眥球后靜脈叢血,通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)(flowcytometer,fc)鑒定和定量分析技術(shù)結(jié)合cd34/cd133雙抗體標(biāo)記技術(shù),檢測(cè)i/r后2h、6h、12h、24h、7d各組大鼠外周血中epcs數(shù)量變化。第三部分:側(cè)腦室注射hpx對(duì)大鼠局灶性i/r后缺血半暗帶區(qū)血管再生的影響。將大鼠隨機(jī)分為sham組、mcao組、mcao+vehicle組、mcao+hpx組以及mcao+hpx+znppix組,造模方法同第一部分,i/r后7d取各組大鼠冠狀面腦組織,即刻切腦組織冰凍切片。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)合免疫熒光顯色技術(shù)檢測(cè)大鼠缺血半暗帶皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)以及紋狀體區(qū)的新生血管數(shù)量,了解epcs向血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化程度以及血管再生情況。結(jié)果:第一部分:與sham組相比,局灶性缺血再灌注損傷可以明顯造成大鼠神經(jīng)功能缺損(p0.05),延長(zhǎng)其逃避潛伏期(p0.05),減少其目標(biāo)象限時(shí)間百分比和穿過(guò)站臺(tái)次數(shù)(p0.05);側(cè)腦室注射hpx治療可以明顯減輕大鼠局灶性i/r后的神經(jīng)功能缺損(p0.05),縮短大鼠局灶性i/r后在水迷宮中的逃避潛伏期(p0.05),增加大鼠在水迷宮中的目標(biāo)象限時(shí)間百分比和穿過(guò)站臺(tái)次數(shù)(均p0.05),提高其學(xué)習(xí)記憶能力;側(cè)腦室注射疊氮鈉對(duì)大鼠局灶性i/r后的神經(jīng)功能缺損和學(xué)習(xí)記憶能力并無(wú)顯著影響(p0.05);和hpx組大鼠相比,側(cè)腦室注射hpx的同時(shí)給予ho-1抑制劑znppix,hpx改善大鼠神經(jīng)功能缺損以及提高大鼠在水迷宮中的表現(xiàn)的作用消失(p0.05)。第二部分:與sham組相比,局灶性缺血再灌注損傷可以誘導(dǎo)缺血半暗帶區(qū)的HO-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平升高和其蛋白質(zhì)的表達(dá)增加(均p0.05),且在I/R后24h達(dá)到高峰,并使外周血中的EPCs數(shù)量增加(p0.05);側(cè)腦室注射HPX治療可以顯著增加大鼠局灶性I/R后不同時(shí)間點(diǎn)缺血半暗帶區(qū)腦組織中的HO-1的蛋白質(zhì)表達(dá)以及其mRNA的轉(zhuǎn)錄水平(均p0.05),上調(diào)外周血中的EPCs數(shù)量(p0.05);疊氮鈉側(cè)腦室注射對(duì)大鼠局灶性I/R后不同時(shí)間點(diǎn)缺血半暗帶區(qū)腦組織中的HO-1的蛋白質(zhì)表達(dá)及其mRNA的水平和外周血中的EPCs數(shù)量無(wú)明顯影響(p0.05)。利用HO-1特異性抑制劑ZnppIX抑制HO-1的活性,可以逆轉(zhuǎn)HPX對(duì)EPCs的骨髓動(dòng)員到外周血的作用,使外周血中的EPCs數(shù)量降低(p0.05)。第三部分:與Sham組相比,局灶性缺血再灌注損傷可以誘導(dǎo)d大鼠缺血再灌注后損傷后7d時(shí)缺血半暗帶區(qū)的血管再生(p0.05);側(cè)腦室注射HPX可以明顯增加大鼠缺血半暗帶皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)以及紋狀體區(qū)I/R后的新生血管數(shù)量(p0.05);疊氮鈉對(duì)大鼠缺血半暗帶區(qū)域的新生血管數(shù)量無(wú)顯著影響(p0.05);ZnppIX可以抑制逆轉(zhuǎn)HPX促進(jìn)大鼠I/R后缺血半暗帶區(qū)血管再生的作用(p0.05)。結(jié)論:HPX可明顯減輕大鼠局灶性腦I/R損傷后認(rèn)知障礙,其機(jī)制可能是HPX通過(guò)上調(diào)HO-1,動(dòng)員骨髓中的EPCs增殖遷移到外周血中,進(jìn)而歸巢到缺血半暗帶區(qū)腦組織中,促進(jìn)其分化成熟并誘導(dǎo)新生血管形成,從而參與受損血管修復(fù)和血管再生。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R614

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本文編號(hào)：1274384