本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)嚴(yán)重?zé)齻笫蟠竽X損傷的研究

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【摘要】：燒傷是熱、電、化學(xué)和放射等造成損傷的總稱,是醫(yī)學(xué)界一直關(guān)注的焦點(diǎn)之一。嚴(yán)重?zé)齻l(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome,SIRS)和多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的死亡率極高。盡管現(xiàn)在醫(yī)療水平的提升降低了心衰、肺水腫、消化道應(yīng)激性潰瘍、急性腎功能衰竭等并發(fā)癥的發(fā)病率,但腦損傷的改善并不明顯。燒傷后腦損傷往往缺乏客觀的診斷指標(biāo),易被燒傷本身嚴(yán)重甚至致命的并發(fā)癥所掩蓋。面積大,創(chuàng)面深的燒傷可引發(fā)中毒性腦病、腦水腫及驚厥,出現(xiàn)腦損害后遺癥。有研究表明:嚴(yán)重?zé)齻? h后血腦屏障開放,并持續(xù)數(shù)天,炎癥反應(yīng)和高糖代謝綜合癥等進(jìn)一步對大腦造成損害。目前,關(guān)于燒傷后大腦損傷研究較少,臨床治療手段主要以對癥支持和控制并發(fā)癥為主,迫切需要探討新的治療方法。干細(xì)胞作為一種起源細(xì)胞,在一定條件下能修復(fù)損傷。近年來,干細(xì)胞療法在神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性病變中得到廣泛的應(yīng)用,比如:腦癱、脊髓損傷、運(yùn)動神經(jīng)元病、帕金森病、腦出血、腦梗塞后遺癥、腦外傷后遺癥等多種疾病。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一種多能干細(xì)胞,易于獲得,具有高度的自我復(fù)制能力,擴(kuò)增能力強(qiáng),免疫原性弱,可以定向分化為多種細(xì)胞,在體內(nèi)移植后可定位在受損的組織內(nèi)并分泌多種細(xì)胞因子修復(fù)損傷,已在臨床應(yīng)用方面取得巨大進(jìn)展。本課題小組以往的研究發(fā)現(xiàn):骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能治療燒傷后肝臟損傷和腸組織損傷。針對嚴(yán)重?zé)齻饳C(jī)體損傷的廣泛性,以及腦損傷的隱匿性,本課題繼續(xù)通過干細(xì)胞移植治療觀察對嚴(yán)重?zé)齻笫蟠竽X損傷的治療效果,并初步探討其可能的修復(fù)機(jī)制。目的:探討B(tài)MSCs靜脈移植后對嚴(yán)重?zé)齻笫蟠竽X損傷的修復(fù)作用并初步探討其作用機(jī)制。方法:采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法,分離、純化BMSCs,通過流式細(xì)胞儀鑒定表面標(biāo)志CD44、CD45、CD90和細(xì)胞周期;并通過誘導(dǎo)所培養(yǎng)的細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化鑒定其為BMSCs。將Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、細(xì)胞治療組。將30%體表面積的背部皮膚浸入97±1℃的水中18 s,制備嚴(yán)重?zé)齻笫竽Ｐ?HE觀察燙傷部位皮膚的病理組織學(xué)改變。燒傷造模后第1 d和第2 d將CM-Dil標(biāo)記的BMSCs分兩次經(jīng)眼靜脈叢靜脈移植到細(xì)胞治療組大鼠體內(nèi),每次0.1 m L PBS細(xì)胞懸液(含5×106個細(xì)胞)。觀察各組體重的變化及一般狀態(tài)。一周后,取大腦組織,HE和尼氏體染色觀察各組大鼠大腦組織病理組織學(xué)改變;免疫組織化學(xué)法檢測燒傷大鼠大腦的神經(jīng)細(xì)胞MAP-2、GFAP、NSE蛋白的表達(dá),凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3,自噬相關(guān)蛋白Beclin 1和LC3B在各組腦組織的表達(dá);TUNEL檢測神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況;Western Blot檢測神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志NSE和GFAP,凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax、Bcl-2、BIM、細(xì)胞色素C、Caspase-3,自噬相關(guān)蛋白Beclin 1和LC3B在各組腦組織的表達(dá);雙免疫熒光檢測神經(jīng)元表面標(biāo)志與自噬相關(guān)蛋白LC3B的共表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡檢測CM-Dil標(biāo)記的BMSCs在腦組織中的定位。結(jié)果:1.BMSCs的培養(yǎng)及鑒定:第3代培養(yǎng)的細(xì)胞呈長梭形,細(xì)胞形態(tài)較單一。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測表明88%細(xì)胞停留在G1期,具有強(qiáng)大的增殖潛力;CD44表達(dá)率92.86%和CD90表達(dá)率95.77%,基本不表達(dá)CD45,符合BMSCs的表面標(biāo)志;經(jīng)向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)后,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測分化細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志MAP-2,并能在成骨誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)下形成鈣結(jié)節(jié),分化為成骨細(xì)胞。2.燒傷大鼠模型的建立:大鼠造模1周內(nèi),燙傷處理后皮膚逐漸變硬發(fā)黑,第7 d伴有結(jié)痂現(xiàn)象,飲食飲水少,精神萎靡;HE觀察燙傷6 h后皮膚出現(xiàn)病理改變,表皮和真皮的附件破壞,細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p壞可判定為深Ⅱ度到Ⅲ度的嚴(yán)重?zé)齻?周后,大腦海馬以及皮層部位細(xì)胞有不同程度的水腫,細(xì)胞核出現(xiàn)固縮;尼氏體染色觀察,大腦海馬以及皮層部位神經(jīng)細(xì)胞的尼氏體減少,排列紊亂。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明模型組大鼠大腦組織的神經(jīng)元標(biāo)志物MAP-2表達(dá)與對照組比較顯著減少(P0.05),神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP顯著增多(P0.05)。3.BMSCs移植對燒傷大鼠的修復(fù)作用:大鼠BMSCs移植后1周,模型組大鼠精神萎靡,進(jìn)食少;而細(xì)胞治療組大鼠較模型組大鼠活潑,進(jìn)食良好。細(xì)胞治療組大鼠的平均體重較模型組有所增加,并呈緩慢上升趨勢。HE病理組織學(xué)觀察結(jié)果表明:BMSCs移植后,與模型組大鼠比較,大腦皮層部位細(xì)胞水腫程度減輕,細(xì)胞核固縮減少;尼氏體染色觀察,細(xì)胞治療組大鼠神經(jīng)細(xì)胞尼氏體增多,排列較整齊。TUNEL法檢測,細(xì)胞治療組大鼠大腦凋亡細(xì)胞的陽性率顯著低于燒傷模型組,均顯著高于對照組(P0.05)。免疫組織化學(xué)和Western Blot檢測結(jié)果顯示:與模型組大鼠相比細(xì)胞治療組大鼠NSE、Bcl-2、Bcl-2/Bax表達(dá)顯著增多(P0.05),兩組均顯著低于對照組(P0.05);細(xì)胞治療組大鼠大腦組織GFAP、p53、Bax、BIM、細(xì)胞色素C、Caspase-3表達(dá)顯著低于模型組(P0.05),顯著高于對照組(P0.05)。雙免疫熒光檢測細(xì)胞治療組大鼠大腦神經(jīng)元(表達(dá)NSE)的自噬陽性細(xì)胞(表達(dá)LC3B)率顯著低于模型組(P0.05),顯著高于對照組(P0.05)。結(jié)論:嚴(yán)重?zé)齻梢鸫竽X組織的損傷,BMSCs移植對燒傷引起的大腦損傷具有修復(fù)作用,具體的機(jī)制可能與抗凋亡和減少自噬相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R644

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本文編號：1273313