發(fā)布時(shí)間：2017-12-08 14:13

  本文關(guān)鍵詞：脊柱結(jié)核microRNA差異表達(dá)譜檢測(cè)及早期診斷分子標(biāo)記物的篩選

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【摘要】：[研究目的]脊柱結(jié)核是骨科臨床常見多發(fā)病,致殘率較高。其早期診斷對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展和愈后起十分重要的作用。其診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、影像學(xué)和相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室檢查而確立,典型脊柱結(jié)核診斷并不困難。但在疾病早期,由于其臨床表現(xiàn)不典型、影像學(xué)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查缺乏特異性,所以早期診斷仍存在較大的問題。篩查脊柱結(jié)核患者外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)差異性表達(dá)的microRNA,建立可用于脊柱結(jié)核早期診斷分子標(biāo)記物,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步的探討。[材料和方法]根據(jù)患者臨床表現(xiàn),影像學(xué)資料和相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室檢查,結(jié)合穿刺活檢或手術(shù)取材病理組織學(xué)檢查結(jié)果選擇脊柱結(jié)核病例；在抗癆治療實(shí)施前抽取外周血標(biāo)本5mL,加入Ficoll試劑后進(jìn)行梯度離心,獲取單個(gè)核細(xì)胞。對(duì)照組人群來源于我院健康體檢中心健康自愿者,同法獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞。再采用Trizol一步法提取總RNA并通過NanoDrop-1000系統(tǒng)完成質(zhì)檢。采用6張Exiqon miRCURY LNATM microRNA (Human)芯片對(duì)病例組(n=4)和對(duì)照組(n=3)樣品進(jìn)行檢測(cè),通過倍數(shù)變化(fold change, FC≥2倍)和統(tǒng)計(jì)學(xué)P值(P0.05),篩選出差異表達(dá)microRNA,與肺結(jié)核相關(guān)研究結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。再通過real-time PCR對(duì)32個(gè)獨(dú)立樣品(病例組n=20；對(duì)照組n=12)中miR-19a-3p, miR-18b-5p,miR-520g-3p和miR-1470的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證芯片數(shù)據(jù)的可靠性。同時(shí),結(jié)合Miranda、 MirBase和TargetScan數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)的microRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)并進(jìn)行GO、Network和Pathway生物信息學(xué)分析。通過分析miR-19a-3p對(duì)脊柱結(jié)核檢測(cè)的特異性和敏感性,建立受試者操作特征曲線(ROC曲線),利用曲線下面積指標(biāo)(AUC)評(píng)價(jià)其對(duì)脊柱結(jié)核的診斷效率。通過RT-PCR檢測(cè)上述32個(gè)獨(dú)立樣品中腫瘤壞死因子(TNF-a)mRNA的表達(dá),結(jié)合miR-19a-3p的數(shù)據(jù)聯(lián)合分析探討兩者之間是否存在基因-靶基因關(guān)系并采用散點(diǎn)圖呈現(xiàn)二者表達(dá)水平的相互關(guān)系。[結(jié)果]7個(gè)樣品的質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果均合格(其中病例組中兩個(gè)樣品獲取的RNA較少,故將兩組RNA樣品混合用于其中1張芯片檢測(cè))。在3,100個(gè)microRNA探針中,共有58個(gè)microRNA呈現(xiàn)差異性表達(dá)(其中上調(diào)基因36個(gè)；下調(diào)基因22個(gè)),其倍數(shù)變化在2.07-13.8之間。與肺結(jié)核前期研究結(jié)果比較,僅有4個(gè)microRNA(has-miR-296, has-miR-377, has-miR-145和has-miR-744)為共存差異表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：miR-19a-3p和miR-18b-5p在病例組表達(dá)降低,而miR-520g-3p和miR-1470在病例組中表達(dá)增高,其結(jié)果與芯片檢測(cè)結(jié)果基本一致。生物信息學(xué)分析顯示：差異表達(dá)的microRNA涉及到從多的靶基因,其中miR-19a-3p在三個(gè)數(shù)據(jù)庫中均為靶基因的數(shù)量為208個(gè)(其中含TNF),在network中處于中心位置。靶基因功能GO分析主要涉及MAKP激酶活性、細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)和巨噬細(xì)胞化學(xué)趨化等；pathway分析靶基因功能主要涉及MAKP、TNF和Rap1等信號(hào)通路。miR-19a-3p檢測(cè)脊柱結(jié)核患者的敏感性為80%,特異性為66.7%,AUC為0.733。miR-19a-3p與TNF-a之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(uperman's rho =0.602,p= 0.014)。[結(jié)論]脊柱結(jié)核與肺結(jié)核microRNA表達(dá)譜之間存在明顯的差異；就靶基因的功能而言主要涉及MAKP、TNF和Rap1等信號(hào)通路,與前人肺結(jié)核的相關(guān)研究結(jié)果相似。miR-19a-3p可能成為脊柱結(jié)核早期診斷分子標(biāo)記物之一；它可能通過調(diào)節(jié)TNF的表達(dá)參與脊柱結(jié)核的病理過程。但該結(jié)論仍有待于更大樣本的驗(yàn)證和熒光素酶等實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R529.2

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